異葒草素對胃癌細胞自噬作用的研究

于海瑤，李石化，孫麗艷，張四喜，王賀雷Δ

(1.長春市食品藥品檢驗中心，吉林 長春 130000；2.吉林大學第一醫院藥劑科，吉林 長春 130021)

?

異葒草素對胃癌細胞自噬作用的研究

于海瑤1，李石化1，孫麗艷1，張四喜2，王賀雷2Δ

(1.長春市食品藥品檢驗中心，吉林 長春 130000；2.吉林大學第一醫院藥劑科，吉林 長春 130021)

目的 研究異葒草素對胃癌細胞自噬的作用。方法 MTT法檢測異葒草素及自噬激活劑和抑制劑對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響；流式細胞儀檢測細胞凋亡的影響；吖啶橙(acridine orange，AO)、單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)染色了解胃癌SGC-7901細胞中自噬溶酶體的產生情況；Western blot檢測自噬特征性蛋白的表達情況。結果 MTT結果提示異葒草素對胃癌SGC-7901細胞增殖具有抑制作用，同時自噬抑制劑能使3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制細胞的凋亡，而自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin，RAP)的作用相反。流式細胞儀檢測細胞凋亡率時異葒草素及RAP能促進細胞凋亡，而3-MA作用相反。AO染色時細胞中出現紅色英光，MDC染色時細胞中出現綠色熒光，說明細胞中出現了自噬溶酶體。Western blot檢測時發現異葒草素作用是細胞中自噬特異性的蛋白LC-3II、Beclin-1表達增高，3-MA抑制上述兩種蛋白的表達，而RAP作用相反。結論 異葒草素能誘導胃癌SGC-7901細胞死亡，自噬參與了其死亡過程。

異葒草素；自噬；胃癌SGC-7901細胞；3-MA；RAP

異葒草素為一種植物提取物，廣泛存在于山楂、鳶尾花等植物，其中西番蓮、竹葉、葒草中的含量最為豐富[1-2]。以往的研究發現異葒草素能夠通過清除DPPH自由基達到抗氧化的目的[3]。同時抑制小鼠單核細胞中NO的釋放進而起到抗炎的作用[2]。隨著科學家對異葒草素的深入研究，其保護臟器[4]、治療糖尿病[5]的功能也逐漸被世人了解。近年來人們逐漸將目光轉移到異葒草素的抗腫瘤作用上來，發現其確實能夠使腫瘤細胞活性下降[6]，但是抗腫瘤的原因尚不明確，本實驗主要探討自噬對異葒草素與抗腫瘤的關系進而為其抗腫瘤的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞：胃癌SGC-7901細胞(吉林大學轉化醫學院惠贈)。

1.1.2 藥品與試劑：異葒草素(上海永恒生物科技有限公司)；MTT(美國Sigma公司)；DMSO(美國MP Biomedicals公司)；RPML-1640培養基(吉諾生物醫藥技術有限公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BIOBOX)(南京碧波生物科技有限公司)；胎牛血清、BCA蛋白定量(美國Thermo Scientific公司)；脫脂奶粉的TBST、TEMED、瓊脂糖(國藥集團化學試劑有限公司)；吖啶橙(acridine orange，AO)、單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapamycin，RAP)(美國Sigma公司)；Beclin-1抗體(英國Abcam公司)；LC3抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；二抗(上海生工生物工程有限公司)；PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.1.3 實驗儀器：超凈工作臺(德國Heraeus公司)；離心機(美國Sigma公司)；酶標儀Gen5 1.10(美國BioTek公司)；流式細胞儀(美國BD FACS Calibur公司)；LX71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；220V電泳供電裝置PowerPac、165-8001型伯樂小型垂直電泳、221BR Trans-Bolt SD半干轉印槽、ChemiDox XRS 凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測細胞活性：取消化處于對數生長期的SGC-7901胃癌細胞并將其接種于96孔板上，每孔細胞數為4×105個。之后將其分為4組，對照組加200 μL 0.1%DMSO；異葒草素組加入40 μM的異葒草素200 μL；3-MA組先加1 mM的3-MA反應30 min后加入等量異葒草素；RAP組先加1 μM RAP作用30 min后加入等量異葒草素。處理24、48、72 h后再加入100 μL終濃度為0.5 mg/mL的MTT，37 ℃孵育4h后棄去上層培養液，加入100 μL DMSO溶解藍紫色結晶，使用酶標儀在490 nm處測定光密度(OD)，并計算抑制率。實驗重復5次。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡：將SGC-7901胃癌細胞接種于培養瓶中隔夜后細胞呈對數生長，之后按1.2.1中分組加入藥物，作用48 h后收集細胞，常溫1000 r/min離心5 min，棄去培養液，使用預冷PBS重懸細胞后再次按上述條件離心，重復2次。將收集細胞用預冷的75%乙醇固定。再次離心后棄去固定液，用PBS洗滌2次。加入200 μL PI，置于4 ℃環境25 min。使用400目篩網過濾1次后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.2.3 AO和MDC染色：將細胞接種于96孔板中培養過夜后按上述分組加入藥物后處理24 h，用PBS洗滌細胞:2次，分別加入100 μL 的1 μg/mL AO，室溫孵育15 min后PBS洗滌。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

MDC染色時加入100 μL的50 μM MDC ，于37 ℃孵育1 h后用PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Western blot：按上述分組處理細胞，之后提取蛋白質，并配置相同濃度的蛋白質溶液。配制15%分離膠，4%濃縮膠，30 g蛋白樣品上樣，調整電壓100 V電泳2 h，之后90 V電壓PVDF膜轉膜90 min，室溫下牛奶封閉1 h，1︰1000的LC-3II和Beclin-1，并置于4 ℃過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。加入二抗(1:5000)室溫下反應1 h，再次使用TBST洗滌。最后化學法發光反應、曝光、拍照并進行灰度值分析。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞活性 異葒草素作用于SGC-7901胃癌細胞后對細胞活性的抑制存在濃度及時間依賴性，與對照組相比具有統計學意義(P<0.05)，同時自噬抑制劑3-MA作用細胞后細胞的活性抑制率較單用異葒草素時有所下降，而自噬激活劑RAP卻相反。見表1。

表1 MTT檢測細胞活性Detection of cell activity by ±s，n=5)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，見圖1。異葒草素組凋亡率為49.78%，當自噬抑制劑作用是凋亡作用下降為17.38%，而自噬激活劑則促進細胞凋亡為65.04%。

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡(n=3)Fig. 1 Detection of cell apoptosis by flow cytometry (n=3)

2.3 AO和MDC染色 AO染色時AO能夠進入細胞核中與DNA結合表現出綠色，而當與自噬溶酶體結合后則會出現紅色熒光。對照組及3-MA組中幾乎無自噬溶酶體出現，而當異葒草素及RAP作用細胞是可見細胞中出現大量自噬溶酶體。同樣MDC染色時MDC可與自噬溶酶體結合表現出綠色熒光。異葒草素和RAP作用于細胞后其中出現大量自噬溶酶體。見圖2。

圖2 AO染色(×100)和MDC染色(×200)Fig.2 AO staining(×100) and MDC staining(×200)

2.4 Western blot檢測自噬特征性蛋白的表達 LC-3II和Beclin-1為自噬特征性蛋白，利用Western blot檢測這2種蛋白的表達情況來進一步明確異葒草素在誘導胃癌細胞凋亡過程中自噬的影響，見圖3。異葒草素作用于胃癌細胞SGC-7901后LC-3II/LC-3I、Beclin-1的灰度值分別為(5.75±0.729)、(5.35±0.973)。與對照組相比，加入自噬抑制劑3-MA后2種蛋白的表達明顯下降，而加入自噬激活劑RAP后2種蛋白的表達明顯增加(P<0.05)。

圖3 Western blot檢測自噬蛋白*P<0.05,與對照組相比Fig.3 Detection of autophagy proteins by Western blot*P<0.05，compared with control group

3 討論

自噬是細胞通過雙層膜結構包裹損傷的細胞器、錯誤折疊的蛋白、侵入的異物等，并將這些物質進行降解的生物學過程[7]。自噬與凋亡一樣也屬于細胞的一種程序化死亡，隨著細胞種類的變化，導致細胞自噬與凋亡發生關系的不同。凋亡與自噬之間即可獨立作用細胞，也可相互影響，進而促進或抑制細胞死亡[8]。異葒草素是一種黃酮類物質，存在于多種植物中，之前的研究發現異葒草素具有抑制HepG2肝癌細胞活性的作用，并且對其凋亡的機制也進行了探討，一方面能啟動死亡受體途徑導致細胞凋亡，另一方面抑制PI3K/Akt、p-Erk1/2等信號通路，降低線粒體膜電位導致細胞的凋亡[9]。但是異葒草素對胃癌細胞的抑制及其機制未見相關文獻報道。本實驗將異葒草素作用于胃癌SGC-7901細胞，通過MTT實驗發現其活性受到抑制，并且自噬抑制劑3-MA能夠阻礙細胞活性的下降，而自噬激活劑RAP作用相反。流式細胞儀檢測細胞凋亡也與MTT相吻合。在胃癌SGC-7901凋亡過程中是否存在自噬的參與，AO、MDC染色均發現自噬溶酶體的產生，Western blot也檢測到了自噬特征性蛋白LC-3II和Beclin-1，并且其表達受到自噬抑制劑及激活劑的影響，故異葒草素在誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡的過程但中存在自噬的參與。自噬是生物體的一項基本的生理過程，廣泛的參與細胞增殖、死亡等一系列過程。尤其是腫瘤細胞當中腫瘤細胞的形成與惡化均與自噬有著密切的聯系[9]，而自噬對細胞死亡的具體過程還有待進一步發現。

[1] Prinz S,Ring A,Huefner A,et al. 4-Acetylvitexin-2-O-rhamnoside,isoorientin,orientin,and 8-Methoxykaempferol-3-O-glucoside as markers for the differentiation of Crataegus monogyna and Crataegus pentagyna from Crataegus laevigata[J].Chem.Biodiversity,2007,4(12): 2920-2931.

[2] Conforti F,Rigano D,Menichini F,et al. Protection against neurodegenerative diseases of Iris pseudopumila extracts and their constituents[J].Fitoterapia,2009,80(1):62-67.

[3] Park HS,Lim JH,Kim HJ,et al. Antioxidant Flavone Glycosides from the Leaves of Sasa borealis[J].Arch Pharm Res,2007,30(2): 161-166.

[4] Lin YP, Chen TY, Tseng HW, et al. Neural cell protective compounds isolated from Phoenix hanceana var. formosana. [J].Phytochemistry,2009, 70(9): 1173-1181.

[5] Alonso-Castro AJ,Zapata-Bustos R,Gómez-Espinoza G,et al. Isoorientin reverts TNF-α-induced insulin resistance in adipocytes activating the insulin signaling pathway[J].Endocrinology,2012,153(11):5222-5230.

[6] Pacifico S,Scognamiglio M,D'Abrosca B,et al. Spectroscopic Characterization and Antiproliferative Activity on HepG2 Human Hepatoblastoma Cells of Flavonoid C-Glycosides from Petrorhagia velutina[J].J Nat Prod,2010,73(12),1973-1978.

[7] Codogno P,Meijer AJ. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death[J].Cell Death Differ,2005,12(2): 1509-1518.

[8] Maiuri MC,Zalckvar E,Kimchi A,et al. Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007, 8(9): 741-752.

[9] 袁莉.異葒草素對HepG2人肝癌細胞凋亡和自噬的作用及機制研究[M].西安：西北農林科技大學，2014.

(編校：王冬梅)

Effects of isoorientin on autophagy of gastric cancer cell

YU Hai-yao1, LI Shi-hua1, SUN Li-yan1, ZHANG Si-xi2, WANG He-lei2Δ

(1. Changchun Food and Drug Inspection Center, Changchun 130000,China; 2.Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo explore effect of isoorientin on gastric cancer cell autophagy. MethodsIsoorientin and autophagy activator and effect of inhibitors on proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 by MTT assay. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Production of autophagy lysosomal in gastric cancer SGC-7901 cells was obseroved by AO and MDC staining. Characteristic expression of autophagy protein was analysed by Western blot. ResultsMTT assay indicated that isoorientin could inhibit gastric cancer cell growth, RAP has the same effects, but 3-MA inhibition of apoptosis. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of isoorientin and RAP could promote cell apoptosis, while 3-MA had the opposite effect. In AO staining, the red light appeared in the cells, and the green fluorescence appeared in the cells of MDC staining, which showed that there was an autophagy in the cells. Western blot test found the isoorientin was cell autophagy specific protein LC-3II, Beclin-1 expression increased, 3-MA suppressed the expression of the two proteins, and RAP had the opposite effect. ConclusionIsoorientin could induce apoptosis in gastric cancer SGC-7901 cells, autophagy is involved in the process of death.

isoorientin; autophagy; gastric cancer cell SGC-7901; 3-MA; RAP

于海瑤，女，碩士，主管藥師，研究方向：食品藥品微生物藥理學，E-mail：514329822@qq.com；王賀雷，通信作者，男，碩士，主治醫師，研究方向：消化道腫瘤的綜合治療，E-mail：wsk01342@163.com。

R285

A

1005-1678(2015)12-0036-03