四種石杉植物甲基轉移酶基因的克隆與序列分析

張君誠，陳作毅，宋育紅

(1.福建省資源環境監測與可持續經營利用重點實驗室，福建 三明 365004; 2.復旦大學-三明學院 天然藥物工程研究中心，福建 三明 365004)

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四種石杉植物甲基轉移酶基因的克隆與序列分析

張君誠1，2，陳作毅1，宋育紅1，2

(1.福建省資源環境監測與可持續經營利用重點實驗室，福建 三明 365004; 2.復旦大學-三明學院 天然藥物工程研究中心，福建 三明 365004)

目的 克隆和分析長柄石杉(Huperziaserratavar.longipetiolata)、閩浙馬尾杉(Phlegariurusminchegensis)、華南馬尾杉(Phlegariurusaustrosinicus)和有柄馬尾杉(Phlegariuruspetiolatus)4種石杉科植物的甲基轉移酶基因編碼區序列。方法 采用RT-PCR技術，以提取的石杉科植物總RNA為模板，擴增得到甲基轉移酶基因編碼區序列，采用BLAST和MEGA 5.0軟件分析克隆的序列進行分析。結果 克隆的4種石杉科植物甲基轉移酶基因序列與數據庫中被注釋為編碼甲基轉移酶的基因序列保持高度的相似性。結論 克隆得到了4種石杉科植物的甲基轉移酶基因，為進一步闡明石杉堿甲生物合成與代謝途徑奠定了基礎。

甲基轉移酶；石杉科；基因克隆；序列分析

石杉科植物屬多年生小型的蕨類植物，普遍含有石杉堿甲(Huperzine A，HupA)[1]，石杉堿甲是一種低毒、高效、高選擇性的中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑，對治療中老年癡呆具有顯著療效[2]。目前石杉堿甲幾乎全部依賴于石杉科范圍內的天然來源[3-5]。石杉堿甲開環的吡啶酮環和六氫吡啶環結構的復雜性，使其人工合成的成本遠高于植物提取[6]，且目前已合成的一百多個石杉堿甲類似物的抑酶活性大多明顯不如天然石杉堿甲[7]。近年來生物合成與代謝工程已成為提高植物次生代謝物產量的潛在途徑之一。在石杉堿甲生物合成過程中，N-甲基轉移酶編碼的蛋白定位于石杉堿生物合成途徑下游石杉堿與石杉堿甲之間甲基轉換的催化酶，可以特異性識別底物并轉移N原子位上的甲基，使得石杉堿甲最終形成[8]。該酶對石杉堿甲生物合成極為重要，但關于該酶基因的研究報道極少[9]，因此，本研究旨在對該酶基因進行克隆及功能分析，有助于闡明石杉堿生物合成代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 藥材及菌株 長柄石杉(Huperziaserratavar.longipetiolata)、閩浙馬尾杉(Phlegariurusminchegensis)、華南馬尾杉(Phlegariurusaustrosinicus)、有柄馬尾杉(Phlegariuruspetiolatus)采集于福建省尤溪縣高山村的福建省石杉科植物種質資源圃。植物材料由復旦大學潘勝利教授鑒定。

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)Top10 菌株由本實驗室提供。

1.2 試劑 TRIzon RNA試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒、高純度質粒中提試劑盒(購自康為世紀公司)；pGEM?-T Easy載體系統試劑盒、M-MLV、RNAsin、Taq DNA聚合酶(購自Promega公司)；dNTP和DNA Marker(購自天根生物公司)；Oligo-DT18、甲基轉移酶基因擴增引物Met-F和Met-R由博尚生物技術有限公司合成。其他試劑均為分析純國產試劑。

1.3 儀器 PTC-100多功能熱循環儀(美國MJ Research)；GIS 2008型凝膠成像系統(上海天能公司)；UV-1240紫外可見分光光度計(日本島津)；HPS-250生化培養箱(武漢愛斯佩科學儀器有限公司)； DYY型雙移定時電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 RNA的提取和cDNA的合成：取4種石杉科植物新鮮材料，使用TRIzon RNA試劑盒提取總RNA；用紫外分光光度計進行濃度及純度的測定；1%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。再利用M-MLV反轉錄酶，按照該試劑盒說明書提供的反應條件和步驟進行實驗操作，將RNA反轉錄成第一鏈互補鏈DNA(cDNA)。

1.4.2 石杉科植物甲基轉移酶基因的擴增及測序：PCR擴增引物根據EST數據庫序列(GenBank: GO913407.1)結合使用primer premier 5.0，oligo 6.0以及NCBI primer blast軟件設計，由博尚生物(BioSune)技術有限公司代理合成，引物Met-F：5′- GCTGCCATTCTTCTCCAA-3′，Met-R：5′-TTGACTCGCC-TAACCCTC-3′。以4種石杉科植物的cDNA為模板，按照以下體系對LDC基因進行擴增：cDNA 2.5 μL，10×Buffer 5.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.25 μL，dNTP mix(10 mM each) 1.5 μL，25 mM MgCl24.5 μL，5 U/μL Taq酶 0.75 μL，終體積為30.0 μL。 反應程序：95 ℃預變性3 min；然后進行32個循環：95 ℃變性30 s，49.0 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；循環結束后72 ℃延伸反應5 min，4 ℃條件下保存。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對擴增所得目的片段進行切膠回收。

將回收產物與pGEM?-T Easy載體連接，使用新制備的Top 10感受態細胞進行轉化，在含有氨芐的LB平板上進行培養，挑取單克隆菌落PCR擴增和電泳檢測后選擇陽性克隆送公司測序。

1.4.3 甲基轉移酶基因序列分析：氨基酸序列比對美國國立生物技術信息中心(NCBI)的蛋白質序列數據庫中的序列，再通過 MEGA 5 構建 Neighbor-joining 系統進化樹。

2 結果

2.1 石杉科植物甲基轉移酶基因克隆 克隆質粒中甲基轉移酶基因片段的擴增結果見圖1，結果顯示甲基轉移酶基因均被接入，條帶約510 bp左右。

圖1 4種石杉科植物甲基轉移酶基因片段的質粒PCR擴增電泳圖M.Marker; 1.長柄石杉; 2.閩浙馬尾杉; 3.華南馬尾杉; 4.有柄馬尾杉Fig.1 Gel electrophoresis of plasmid PCR amplification of methyltransferase gene in four species of HuperziaceaeM.Marker;1.Huperzia serrata uar.longip etiolata;2.Phlegariurus.minchegensis;3.Phlegariurus.austrosinicus;4.Phlegariurus.petiolatus

2.2 各材料甲基轉移酶基因的nucleotide blast下的blastn比對 通過blastn比對，4條序列測序結果在Nucleotide collection(nr/nt)核酸非冗余數據庫均未獲得相似性高的序列比對。

2.3 各材料甲基轉移酶基因序列的blastx比對及系統發生構建 通過在蛋白質數據庫中比對核酸序列翻譯的氨基酸序列，可知各實驗材料甲基轉移酶基因均被注釋為甲基轉移酶，進一步佐證了所獲得的基因序列為預期的酶基因。

從NCBI的非冗余蛋白數據庫(Nr) 中選取與4種石杉科植物LDC基因編碼蛋白相似性高的11個物種共17條LDC蛋白序列，使用Mega 5.0軟件構建Neighbor Joining Tree系統進化樹，氨基酸序列使用Clustal W下gonnet打分矩陣比對后，使用Bootstrap Method重復1000次算法下使用Poisson model計算各物種間兩兩距離。構建的Neighbor Joining Tree樹型圖，見圖2。

圖2再次驗證了克隆的4種石杉科植物材料基因序列編碼的蛋白質為甲基轉移酶。在系統發生樹中，石杉科植物甲基轉移酶與毛果楊(Populustrichocarpa)、毛白楊 (Populustomentosa)、蓖麻(Ricinuscommunis)、正葡萄(Vitisvinitera)的氧甲基轉移酶相似性高，與蕨類植物江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)的氧甲基轉移酶也保持較高的相似性。

圖2 各材料甲基轉移酶基因編碼氨基酸序列的Neighbor Joining系統發生構建▲代表4種石杉科植物甲基轉移酶氨基酸序列；●代表EST引物設計序列GO 914756.1Fig.2 Phylogenetic analysis of the methyltransferase amino acid sequence▲represents sequence of methyltransferase gene in the four species of Huperziaceae; ●represents ESTprimer design sequence GO 914756.1

3 討論

如前已述，N-甲基轉移酶(基因)催化石杉堿中間物N原子上甲基的轉移，催化石杉堿與石杉堿甲之間的互相轉化和石杉堿甲構造形成，是石杉堿甲生物合成途徑的重要酶(基因)。在細菌、真菌、植物、動物甚至是人類基因組上關于甲基轉移酶基因的克隆與分析有廣泛的研究[10-14]，但對石杉科植物的研究報道不多，本研究組已報道的研究實驗結果認為該基因雖然對于石杉堿生物合成不可或缺，但應該不是關鍵的限速酶[9]。

本研究克隆得到的4條甲基轉移酶序列通過blastn比對雖然在Nucleotide collection(nr/nt)核酸非冗余數據庫均未獲得相似性高的序列比對，但通過在蛋白質數據庫比對核酸序列翻譯的氨基酸序列，可知各實驗材料甲基轉移酶基因均被注釋為甲基轉移酶，佐證了所獲得的基因序列為預期的酶基因。這可能與密碼子的偏愛性有關。在不同的物種中，由于生物基因組中的堿基含量不同，使得不同的密碼子翻譯的氨基酸相同，在進化關系上，體現出蛋白質的保守型大于核苷酸序列[15]。Banks JA等[16]對石松目中的江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)的全基因組進行測序，對其表達和調控做了相關分析，其中江南卷柏的氧甲基轉移酶的氨基酸序列與石杉科植物甲基轉移酶氨基酸序列保持較高的相似性，說明該氨基酸序列表達的蛋白可能與江南卷柏的氧甲基轉移酶具有相似的生物學功能。進化分析顯示(見圖2)克隆獲得的石杉科植物甲基轉移酶與毛果楊(Populustrichocarpa)、毛白楊(Populustomentosa)等植物的甲基轉移酶的有高相似性，進一步佐證了所克隆的基因是甲基轉移酶基因。研究結果豐富了為數不多的石杉科植物石杉堿生物合成與代謝調控可能途徑中涉及到的關鍵酶基因序列，為進一步實現石杉堿甲生物合成奠定了必要的分子基礎。

[1] 楊明，姚志偉，趙毅民，等.HPLC法測定石杉科植物中石杉堿甲的含量[J].軍事醫學科學院院刊，2000，24(2)：123-125.

[2] 王月娥，岳東賢，唐希燦.石杉堿甲的抗乙酰膽堿酯酶的作用[J].中國藥理學報，1986，7(2)：110.

[3] Ma XQ,Gang DR.The Lycopodium alkaloids[J].Nat Prod Rep,2004,21(6):752-772.

[4] Ma XQ,Tan CH,Zhu DY,et al.Is there a better source of huperzine A than Huperzia serrata? Huperzine A content of Huperziaceae species in China [J].J Agric & Food Chem,2005,53(5):1393-1398.

[5] 張君誠，黃暉，張杭穎，等.武夷山脈石杉科植物石杉堿甲含量的研究[J].植物遺傳資源學報，2011，12(4)：629-633.

[6] 陳業高，劉怡君，蔣金和，等.石松類生物堿成分研究的新進展[J].云南師范大學學報，2010，30(6)：12-24.

[7] 易家寶，顏杰，李旭明.石杉堿甲結構改造的研究進展[J].天然產物研究與開發，2009，21(6)：1080-1083，1987.

[8] Choi KB,Morishige T,Shitan N,et al.Molecular cloning and characterization of coclaurine -methyltransferase from cultured cells of Coptis japonica[J].J Biol Chem,2002,277(1):830-835.

[9] 張君誠，陳作毅，宋育紅.石杉堿甲生物合成與代謝調控關鍵基因的差異表達分析[J].中華生化藥物雜志，2015，35(1)：1-5.

[10] Chen YT,Shu HY,Li LH,et al.Complete Nucleotide Sequence of pK245,a 98-Kilobase Plasmid Conferring Quinolone Resistance and Extended-Spectrum-β-Lactamase Activity in a Clinical Klebsiella pneumoniae Isolate[J].Am Soc Microbiol,2006,50(11):3861-3866.

[11] Engel SR,Dietrich FS,Fisk DG,et al.The Reference Genome Sequence of Saccharomyces cerevisiae:Then and Now[J].G3,2014,4(3):389-398.

[12] Park J,Chen Y,Tishkoff DX,et al.SIRT5-Mediated Lysine Desuccinylation Impacts Diverse Metabolic Pathways[J].Mol Cell,2013,50(6):919-930.

[13] Hillier LDW,Fulton RS,Fulton LA,et al.The DNA sequence of human chromosome 7[J].Nature,2003,424(6945):157-164.

[14] Khurana P， Gaikwad K.The map-based sequence of the rice genome[J].Nature,2005 ,436(7052):793-800.

[15] Krebs JE.Lewin基因X[M].北京:科學出版社,2013.

[16] Banks JA,Nishiyama T,Hasebe M,et al.Selaginella Genome Identifies Genetic Changes Associated with the Evolution of Vascular Plants[J].Science,2011,332 (6032):960-963.

(編校：王冬梅)

Cloning and sequence analysis of methyltransferase gene in four species of Huperziaceae

ZHANG Jun-cheng1,2, CHEN Zuo-yi1, SONG Yu-hong1,2

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Monitoring Resource Environment and Sustainable Management Utilization, Sanming 365004, China; 2.Research Center of Natural Medicines Engineer, Fudan University & Sanming College, Sanming 365004, China)

ObjectiveTo clone and analyze the coding region of methyltransferase gene from four species of Huperziaceae, the species includedHuperziaserratavar.longipetiolata,Phlegariurusminchegensis,PhlegariurusaustrosinicusandPhlegariuruspetiolatus.MethodsThe methyltransferase coding region sequences were cloned by RT- PCR with the template of total RNA extracted from four Huperziaceae．Then the sequences were analyzed by means of BLAST and MEGA 5.0 software.ResultsThe coding region sequences of the four species of Huperziaceae were highly similar to the methyltransferase in the database.ConclusionThe methyltransferase genes of the four species of Huperziaceae were cloned in this study.The result will provide a foundation for further elucidate the mechanism of Huperzine A biosynthesis and metabolic pathways in Huperziaceae plants.

methyltransferase; Huperziaceae; gene cloning; sequence analysis

福建省自然科學基金面上項目(2012J01145)；三明學院生物學省級重點學科開放基金項目

張君誠, 男，博士，教授，研究方向：藥用植物資源與生物技術研究，E-mail：5988603101@163.com。

R931

A

1005-1678(2015)07-0013-04