miR-199a對膀胱癌抑制作用的研究

白羽，臧學麗，張四喜，徐廣宇

(1.吉林醫藥學院 藥學院，吉林 吉林 132013；2.長春醫學高等專科學校 藥學系，吉林 長春 130031；3.吉林大學第一醫院 藥劑科，吉林 長春 130021；4.北華大學 藥學院，吉林 吉林 132013)

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miR-199a對膀胱癌抑制作用的研究

白羽1，臧學麗2，張四喜3，徐廣宇4

(1.吉林醫藥學院 藥學院，吉林 吉林 132013；2.長春醫學高等專科學校 藥學系，吉林 長春 130031；3.吉林大學第一醫院 藥劑科，吉林 長春 130021；4.北華大學 藥學院，吉林 吉林 132013)

目的 研究miR-199a對膀胱癌的抑制作用。方法 按處理方法不同將T24膀胱癌細胞分為空白對照組(control group)、pre-scamble轉染組(pre-scamble group)、pre-miR-199a轉染組(pre-miR-199a group)。采用MTT法檢測轉染miR-199a對細胞增殖的影響，用流式細胞儀檢測轉染miR-199a后對細胞凋亡及細胞周期的影響，Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。結果 pre-miR-199a group OD 值(0.436±0.042)顯著低于control group(0.634±0.020)和pre-scamble group(0.601±0.059)(P<0.05)。pre-miR-199a group細胞凋亡率為(19.25±1.57)%，顯著高于control group(10.19±0.98)%和pre-scamble group(12.27±1.38)%(P<0.05)。Control group、pre-scamble group和pre-miR-199a group的G1期細胞百分比分別為45.09%、47.57%、58.62%，轉染pre-miR-199a使細胞停滯在G1期。pre-miR-199a group細胞透過濾膜的平均個數為(46.00±1.58)個，顯著低于control group(67.00±1.58)個、pre-scamble group(61.20±1.30)個(P<0.05)。結論 miR-199a能抑制膀胱癌細胞的生長。

miR-199a；膀胱癌；增殖；凋亡；細胞周期；侵襲

膀胱癌是臨床上常見的腫瘤，據統計其發病率在世界范圍內的惡性腫瘤中占第7位。在中國，膀胱癌是泌尿生殖系統發病率最高的腫瘤[1-2]。因此膀胱癌的治療任重而道遠。隨著基因治療的不斷深入，miRNAs在腫瘤的早期診斷、預后判斷與治療開辟了新的道路[3]。最近的研究表明miR-199a參與多種細胞腫瘤的形成與發展。Murakami[4]發現肝癌細胞中miR-199a的表達明顯降低。Yu T[5]研究發現miR-199a在口腔癌的發展過程密切相關，并作為病情判斷的指標。但目前很少有對miR-199a對膀胱癌抑制作用的報道，本實驗旨在揭示miR-119a與膀胱癌形成的關系，為膀胱癌的治療提供新的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：T24膀胱癌細胞株購自中科院上海細胞庫

主要試劑：胎牛血清、DMEM高糖培養基、青鏈霉素、PBS磷酸緩沖液，購自Hyclone；LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑、Trizol試劑，購自Invitrogen；Opti-MEM培養基，購自Gibco；Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒，購自Keygen；細胞周期檢測試劑盒，購自凱基生物公司；Transwell細胞培養板，購自BD公司。

儀器：細胞培養箱、Multiskan Spectum Microplate 酶標儀，購自Thermo scientific；BDFACSCantoII流式細胞儀，購自BD公司；超凈工作臺，購自蘇州安泰公司；U-CTR30-2倒置光學顯微鏡，OLYMPUSCKX41。

引物miR-199a，miR-199a-RT 5’-CTCAACTGTCGTGGAGT-CGGCAATTCAGTTGAGGAACAGGT-3’;miR-199a-F 5’-ACACTC-CAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3’;miR-199a-R 5’-TGGTG-TCGTGGAGTCG-3’上海英俊生物公司提供；miRNA模擬物，Pre-miR negative control。

1.2 方法 按照司彤[6]的方法并稍作修改進行細胞復蘇、細胞培養。

1.2.1 MTT實驗：將處于對數生長期的細胞消化成單細胞懸液，接種于96孔板，5×103細胞/孔，每組3個復孔，讓細胞進行傳代，當細胞匯合度達到50%～60%時使用pre-miR-199a(由miR-199a引物轉染)、pre-scramble(由不含miR-199a的miRNA模擬引物轉染)進行轉染。轉染時每孔加入200pmol RNA oilgo、5 μL Lipofectamine 2000、500 μL無血清培養液，混勻后室溫孵育20 min，6h后更換為10%小牛血清培養基。按處理方法不同分為空白對照組(control group)、pre-miR-199a轉染組(pre-miR-199a group)、pre-scamble轉染組(pre-scamble group)。棄去培養液，用PBS洗滌細胞3次，每孔加入無血清培養液，加入轉染混合物，37 ℃，5%CO2培養，6 h后換成10%血清的培養液。培養72 h后棄去培養液，每孔加入100 μL 1:10稀釋的MTT底物溶液，于37 ℃反應2 h后使用酶聯儀測OD450 nm處的吸光度，計算細胞增殖的抑制率。

1.2.2 流式細胞儀測細胞凋亡：將細胞培養板中的細胞用2 mL PBS洗滌，之后棄去PBS溶液，將細胞置于冰上，加入0.25%的胰蛋白酶0.5 mL，孵育，并輕輕吹打使細胞從培養板壁上脫落。將細胞預冷與1×結合緩沖液中使其密度約為1×106細胞/mL。取0.5 mL細胞懸液到離心管中，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室溫下避光反應15 min，之后常溫1000 r/min，離心5 min，棄去上清，再次用0.5 mL預冷的1×結合緩沖液重懸，加入10 μL Propidium Iodide，用流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.3 流式細胞儀測細胞周期：按上述方法進行轉染48 h后，將細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，4 ℃，1000 r/min，離心5 min，PBS充分懸浮細胞，上述條件再次離心2次，加入-20 ℃預冷的75%乙醇1 mL，混勻后4 ℃固定24 h。離心收集細胞，用1 mL PBS洗滌細胞，加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化丙啶，100 μg/mL RNaseA，0.2%Triton-X-100,4 ℃避光孵育30 min，之后用流式細胞儀分析。

1.2.4 Transwell侵襲實驗：調整處于對數生長期的B、C組細胞，使細胞密度為1×105細胞/mL，將100 μL細胞懸液加入Transwell小室，將600 μL完全培養液加入對應的底部24孔板各孔中，于37 ℃，5%CO2培養16 h，之后用棉簽擦除Transwell小室內部的細胞，乙醇固定細胞10 min，用結晶紫染液染色。顯微鏡下觀察處于微孔濾膜側面上的侵襲的腫瘤細胞，400倍顯微鏡(OLYMPUSCKX41)下計數隨機5個不同視野的侵襲細胞數，取平均值，細胞數目反映了細胞侵襲能力的高低。

2 結果

2.1 MTT實驗 結果發現，轉染pre-miR-199a后的OD值顯著低于control group和pre-scamble group(P<0.05)見表1。

表1 MTT法觀察各組T24膀胱癌細胞的增殖(n=3)Tab.1 Proliferation of T24 bladder cancer cell in each group determined by MTT method(n=3)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group；#P<0.05，與pre-scramble group比較，#P<0.05，compared with pre-scramble group

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 經pre-miR-199a轉染后T24膀胱癌細胞的凋亡率為(19.25±1.57)%，與control group (10.19±0.98)%和pre-scamble group (12.27±1.38)%相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細胞儀對細胞凋亡的檢測(n=3)*P<0.05，與control group比較；#P<0.05，與pre-scramble group比較Fig.1 Cell apoptosis detected by flow cytometry(n=3)*P<0.05，compared with control group; #P<0.05，compared with pre-scramble group

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 Control group、pre-scamble group和pre-miR-199a group的G1期細胞百分比分別為45.09%、47.57%、58.62%，可見轉染pre-miR-199a使細胞停滯在G1期。見圖2。

圖2 流式細胞儀對細胞周期的檢測Fig.2 Cell cycle detected by flow cytometry

組別細胞周期(%)G1SG2空白對照組45.0934.5820.33pre-scamble轉染組47.5733.3219.11pre-miR-199a轉染組58.6224.1817.20

2.4 Transwell侵襲實驗 Transwell侵襲實驗是通過計數細胞透過濾膜的個數來衡量細胞侵襲能力的，見圖3。3組細胞透過濾膜的平均個數分別為(67.00±1.58)、(61.20±1.30)、(46.00±1.58)個。可見pre-miR-199a group與其余2組相比具有明顯的差異性(P<0.05)。說明T24膀胱癌細胞在轉染pre-miR-199a后細胞侵襲能力下降。

圖3 Transwell實驗結果(×400,n=5)*P<0.05，與control group比較；#P<0.05，與pre-scramble group比較Fig.3 Result of transwell experiment (×400,n=5)*P<0.05，compared with control group; #P<0.05，compared with pre-scramble group

3 討論

miRNA屬于小RNA家族，通常長度為18～24個核苷酸。其大部分位于編碼蛋白或非編碼蛋白mRNA轉錄物的內含子中[7-8]。目前對miRNAs的了解甚少，目前的研究發現miRNA參與細胞的增殖、凋亡、分化、代謝以及個體發育和病毒感染等過程[9]。尤其是miRNA對腫瘤細胞增殖的影響成為目前研究的熱點。Porkka KP等[10]發現miR-199a在前列腺癌中的表達下調。Lee JW等[11]的研究發現miR-199a在宮頸癌中的表達上調。可見miR-199a在個腫瘤細胞中的作用不盡相同。本研究中通過MTT實驗及流式細胞儀檢測細胞凋亡發現轉染miR-199a后膀胱癌細胞的增殖明顯受到了影響。一般細胞的分裂要經歷G0/G1、S以及G2/M期，代表DNA合成前期、DNA的合成期和DNA的合成后期。本實驗的流式細胞檢測結果顯示轉染miR-199a能使膀胱癌細胞停滯在G1期，通過影響DNA的合成進而干擾膀胱癌細胞的有絲分裂。腫瘤細胞的侵襲是其生長的主要方式，腫瘤細胞可以呈巢或條索狀沿組織間隙生長，破壞原有的組織結構，也可以如流水樣沿組織間隙擴散，保留原有的組織結構。但無論怎樣侵襲是惡性腫瘤的重要標志，常發生于腫瘤的晚期階段，對治療帶來極大的挑戰。本研究中轉染miR-199a后可見膀胱癌對組織的浸潤能力遠較其他組下降。更進一步明確了其在對抗膀胱癌中的作用。miRNA抑制腫瘤的細胞的作用機制各異，miR-29a能抑制乳腺癌TTP蛋白的高表達[12]。MiR-15a和miR-16通過調節AKT3、RPS6、MAP激酶和NF-κB激活MAP3KIP3進而發揮其抗腫瘤活性[13]。關于miR-199a抑制膀胱癌的作用機制有待于進一步的研究明確。

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(編校：王儼儼)

Inhibitory effect of miR-199a on bladder cancer

BAI Yu1, ZANG Xue-li2, ZHANG Si-xi3, XU Guang-yu4

(1.College of Pharmacy, Jilin Medical University, Jilin 132013, China; 2.Department of Pharmacy,Changchun Medical College, Changchun 130031, China; 3.Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China; 4.College of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013,China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of miR-199a on bladder cancer.MethodsT24 bladder cancer cells were divided into control group, pre-scamble group and pre-miR-199a group according to different treatment.Cell proliferation was assayed by MTT, cell apoptosis and cell cycle by flow cytometry, and cell invasion by Transwell.ResultsThe OD value of pre-miR-199a group (0.436±0.042) was significantly lower than that of control group (0.634±0.020) and pre-scamble group (0.601±0.059)(P<0.05).Cell apoptosis of pre-miR-199a group(19.25±1.57)% was higher than that of control group(10.19±0.98)% and pre-scamble group(12.27±1.38)%(P<0.05).The cell ratio in G1 phase of control group、pre-scamble group and pre-miR-199a group was 45.09%, 47.57%, and 58.62%, respectively.The cell cycle arrested in G1 phase after transfected with pre-miR-199a.The cells migration number of pre-miR-199a group (46.00±1.58) was lower than those of control group(67.00±1.58) and pre-scamble group(61.20±1.30)(P<0.05).ConclusionMiR-199a could inhibit the growth of bladder cancer cells.

miR-199a; bladder cancer; proliferation； apoptosis; cell cycle; migration

衛計委吳階平專項基金(320.6750.13216)；吉林省教育廳資助項目(吉教科合字[2014]第505 號)；北華大學博士啟動基因項目(2014)

白羽，女，博士，講師，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail：baiyu218@163.com；徐廣宇，通訊作者，男，博士，講師，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：xuguangyu2005@163.com。

R737.14

A

1005-1678(2015)07-0032-03