原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球的制備及理化特性研究

王大衛，溫寶芳，商洪才，馮占芹，張維芬,Δ

(1.朐山醫院 中醫內科，山東 臨朐 262600；2.濰坊醫學院 臨床學院，山東 濰坊 261053；3.北京中醫藥大學中醫內科學教育部重點實驗室/中醫內科學北京市重點實驗室，北京 100000；4.濰坊醫學院 藥學院，山東 濰坊 261053)

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原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球的制備及理化特性研究

王大衛1?，溫寶芳2?，商洪才3，馮占芹4，張維芬3,4Δ

(1.朐山醫院 中醫內科，山東 臨朐 262600；2.濰坊醫學院 臨床學院，山東 濰坊 261053；3.北京中醫藥大學中醫內科學教育部重點實驗室/中醫內科學北京市重點實驗室，北京 100000；4.濰坊醫學院 藥學院，山東 濰坊 261053)

目的 制備原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球并對其理化特性進行考察。方法 采用噴霧干燥法制備原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球，掃描電鏡觀察不同藥物載體比例微球的粒徑、外觀，并對其體外釋放、含水率、溶脹率、固密度等理化特性進行考察。結果 噴霧干燥法成功構建原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球A、B、C 3種微球，電鏡結果顯示原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球平均外觀圓整，表面有褶皺，粒徑在2～15 μm分布均勻；體外釋放結果表明，原花青素A、B、C 3種微球累計釋放分別為25.07%、38.83%和60.00%，無突釋現象；原花青素24 h時累計釋放分別為28.42%、41.82%和67.52%，48 h累計釋放分別為28.89%、43.17%和72.86%，微球具有緩釋作用。含水率、溶脹率、固密度結果分為15.35%～23.51%、46.50%～105.80 %、0.375～0.496。結論 噴霧干燥法成功構建原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球，微球表面有褶皺，粒徑固密度、溶脹等特性良好，具有緩釋作用，有望成為肺吸入給藥的良好載體。

原花青素；白芨多糖；殼聚糖；噴霧干燥；微球；理化特性

近年來研究發現，大氣顆粒物嚴重影響人體健康，PM2.5每年造成80萬人死亡，已經成為致死的重要因素[1]。大氣顆粒物是懸浮于空氣中顆粒的總稱，按照其空氣動力學粒徑分為總懸浮顆粒物(TSP， 空氣動力學直徑小于 100 μm，下同)、可吸入顆粒物(PM10)、細顆粒物(PM2.5)和超細顆粒物(PM0.1)[2]。PM10通常沉積在上呼吸道、氣管和主支氣管；PM2.5主要沉積到細支氣管、肺泡[3]，其中更細的成分PM0.1還可以穿過肺泡進入血液。短期暴露于PM2.5與呼吸系統疾病的入院率有關，PM2.5質量濃度每升高10 μg/m3，呼吸系統疾病的病死率就會升高1.51%[4]。研究人員對北京市PM2.5暴露的急性健康損害風險和經濟損失進行了評估，結果顯示急性支氣管炎和哮喘是 PM2.5引發的主要疾病，占90%以上[5]。大氣粗顆粒物可誘導人肺 A549 上皮細胞產生大量超氧陰離子和過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等，引起細胞氧化應激[6]。PM2.5進入機體后，可促進一氧化氮( nitric oxide，NO)、一氧化氮合成酶( nitric oxide synthase，NOS) 、丙二醛(malonaldehyde，MDA)等氧化產物增加，同時抑制谷胱甘肽過氧化物(glutathione peroxidase，GSH-Px) 、超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD) 、過氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化產物的產生，最終導致機體總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)下降[7]。PM2.5容易吸附各種有毒的有機物和重金屬，引起氧化應激和炎癥反應，導致機體損傷，被認為是影響健康的主要作用機制[8]。由此可見，空氣污染對健康的影響已成為我國重要的公共衛生問題，針對PM2.5造成的健康風險進行有效的干預，已成為我國醫藥研究領域亟需解決的重大科學問題，而目前尚無有效的預防及治療辦法，如何利用中醫藥特有的優勢對相關疾病進行科學、有效應對也成為醫藥工作者重要的責任、契機和挑戰[6]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是葡萄籽中提取的多酚類物質，是由兒茶素、表兒茶素及其沒食子酸酯組成的多聚體[9]，具有抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、保護心血管等藥理作用[10-11]。馬玉紅等[13]研究H2O2誘導PC12細胞的內質網應激損傷作用及原花青素對其預防作用發現，原花青素可以顯著減少細胞內活性氧(ROS)生成，結果表明原花青素可減輕H2O2引起PC12細胞的內質網應激損傷。趙艷萌等[12]研究發現葡萄籽原花青素對順鉑所致大鼠腎臟氧化損傷和線粒體損傷具有防護作用。原花青素是一種很好的氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑[13]，但原花青素體外穩定性差，隨聚合度增加，口服吸收降低[14-15]，臨床應用受到限制。因此，利用原花青素具有抗氧化損傷的優勢，通過新劑型和給藥途徑研究，提高原花青素的生物利用度，促進藥物吸收。

肺吸入微球給藥系統是近年來發展起來的新劑型，微球沉積于肺部可以延緩藥物的釋放，且可保護藥物不受酶的水解，可以通過工藝的優化，得到大小、形狀和孔隙率符合要求的微球，這些特性決定了微球是較好的肺部給藥制劑，生物可降解微球作為肺部控釋給藥載體受到廣泛關注。

采用生物降解材料制備的微粒載藥系統被廣泛用于干粉吸入給藥[16-17]，作為天然可降解的高分子載體材料，殼聚糖微球具有的獨特的物理化學和生物學性質，使其尤其適用于肺部給藥系統[18-20]。白芨多糖是從白芨藥材中經一定工藝提取所得的多糖 ，具有抗炎 、 促凝血 、 抗病毒 、 抗腫瘤 ，抗氧化等生物學活性[21]， 作為天然高分子材料 ， 有功能緩釋性、局部滯留性、自身降解性、無刺激性、無不良反應等特性，用白芨膠制備的混懸型洗劑、搽劑，穩定性好[22]。

本研究以白芨多糖/殼聚糖作為藥物載體，原花青素為模型藥物，采用噴霧干燥法制備原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球，并對微球形態、粒徑、含水率、溶脹率、固密度、體外釋放等理化特性進行評價，為開發防治PM2.5引起肺氧化損傷的吸入給藥系統提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 殼聚糖(CTS，脫乙酰度≥85%，山東萊州市海力生物制品有限公司)；冰乙酸(青島海濱試劑，AR)；白芨多糖(北京華清美恒天然產物技術開發有限公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(上海化學試劑公司，AR)。

1.2 儀器 EL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Büchi?290小型噴霧干燥儀(瑞士步琦有限公司，噴嘴直徑0.7 mm)；JCM-6000 NeoScope 臺式掃描電鏡(Scanning Electron Microscope，怡星公司)；UV-8000/8000A/8000S雙光束紫外分光光度計(Ultraviolet Spectrophotometric， 上海元析儀器有限公司)；GWJ-4型智能粒徑檢測儀(天津天大天發科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球的制備：精密稱取室溫下真空干燥至恒重的白芨多糖及原花青素各適量，溶于1000 mL 0.5%的殼聚糖乙酸溶液中，0.45 μm微孔濾膜過濾，續濾液經蠕動泵導入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴，噴霧干燥條件為進口溫度：110 ℃、出口溫度：55 ℃～75 ℃，進料速度：3 mL/min、空氣流量：400 L/h，噴霧干燥“一步”制得微球粉末A、B、C、D，收集微球粉末于干燥器中，備用條件見表1。

表1 噴霧干燥微球的處方組成(%，W/V)Tab.1 Composition of formulations used for aqueous solution to be spry dried(%，W/V)

1.3.2 微球粒徑：取適量干燥后的載藥微球加至超純水中，磁力攪拌器使其分散均勻后，放入激光粒度分析儀中測定微球的直徑及粒徑分布。

1.3.3 微球形態：取少許粉末樣品撒于樣品蓋上，噴金，然后在高壓條件下成像，用掃描電鏡觀察。

1.4 含水率 取數個規格相同且干燥恒重的稱量瓶，分別稱其重量記為Wn，分別加入適量的微球后稱其重量，記為W(其中藥物重為W-Wn)，移至105 ℃烘箱中干燥4 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定重量(W′)，再置105 ℃烘箱中干燥0.5 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定重量(W′)，2次恒重之差不超過0.3 mg，計算微球的含水率。則含水率的計算公式為(1)：

(1)

1.5 溶脹率 精密稱取干燥的原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球適量(Wd)分散于5 mL試管中，加入4 mL 磷酸鹽緩沖溶液(0.2 M，pH 6.8)溶解，漩渦振蕩5 min，置于室溫12 h以上直至達到溶脹平衡，離心，棄去上清液，用濾紙將微球表面的水分吸干，精密稱重溶脹后的微球 (Wn)，按下式計算溶脹率(SR%)(2)：

(2)

1.6 固密度 參考USP24附錄(616)的方法測定粉末固密度，將各處方的粉末填充于小塑料瓶(5 mL)中，從一定高度(約14 mm)按規定次數(20次)落下，利用落下的撞擊力使粉末裝緊，并不斷加入粉末，直至填滿且溢出瓶口，刮去多余粉末，準確測定粉末重量及塑料瓶內容積，將粉重和容積相比即得粉末的固密度。

1.7 體外釋放 精密稱取不同比列微球置于扎緊一端的透析袋內(MWCO：3500)，加釋放介質0.2 M pH 6.8磷酸鹽緩沖液2 mL封口，置于裝有50 mL釋放介質的具塞錐形瓶中于37 ℃條件下，恒溫振蕩器(100 r/min)定時取樣2 mL釋放介質，并隨時補充同溫等量新鮮介質，以空白微球為對照，在286 nm波長處測定吸光度(A)，根據標準曲線回歸方程，計算原花青素在溶液中的累計釋放量(cumulative release， CR)(3)：

(3)

式中：Mt是微球在PBS溶液中t時間時茶堿的釋放量，M0為微球中的藥物含量。

2 結果

2.1 微球的電鏡掃描結果 微球表面呈光滑球形、半褶皺或全褶皺的3種不同形態微粒，隨著白芨多糖含量的升高，噴霧干燥微粒表面褶皺程度逐漸不明顯,白芨多糖/殼聚糖空白微球D表面呈光滑球形。微球A均有褶皺，大小均勻，無粘連；微球B具有褶皺，粒徑較不均勻；微球C有的具有半褶皺，部分表面光滑，有粘連；白芨多糖/殼聚糖空白微球D大部分表面光滑，分布均勻，無明顯粘連。見圖1。

圖1 微球的電子顯微鏡掃描圖A.原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球(1︰1 ︰1)；B.原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球(1︰2 ︰1)；C.原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球(1︰4 ︰1)；D. 白芨多糖/殼聚糖空白微球(1︰1)Fig.1 Scanning electron micrograph images of chitosan and amino-chitosanA. PC/ BSP/CTS microspheres (1:1:1); B.PC/ BSP/CTS microspheres(1:2:1);C.PC/BSP/CTS microspheres (1:4:1); D.Blank BSP/CTS microspheres(1︰1)

2.2 不同藥物載體比例原花青素微球的粒徑 用粒度分析儀測得所制備的原花青素/白芨多糖/殼聚糖4種微球粒徑的分布范圍分別是10～20、2～15、10～25、2～15 μm，粒徑分布在2～15 μm范圍內的微球占總數的87.9%，各組微球粒徑分布較均勻。見圖2。

圖2 不同藥物載體比例原花青素微球的粒徑A.原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球(1︰1 ︰1)；B.原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球(1︰2 ︰1)；C.原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球(1︰4 ︰1)；D.白芨多糖/殼聚糖空白微球(1︰1)Fig.2 The PC microspheres particle size of the proportion of different drug carriers(n=3)A.PC/ BSP/CTS microspheres (1:1:1); B.PC/ BSP/CTS microspheres(1:2:1);C.PC/BSP/CTS microspheres (1:4:1); D.Blank BSP/CTS microspheres(1:1)

2.3 不同藥物載體比例原花青素微球的含水率、溶脹率和固密度 在相同的相對濕度和時間條件下，微球A，B，C，D的含水率分別為19.20%，26.51%，15.35%，16.80%，見圖3(A)。由此圖可以知，在相同的相對濕度和時間時，微球C含水率低于其他3種微球，這會使顆粒間易于粘連，影響微球的性能。

圖3 不同藥物載體比例原花青素微球的(A)含水量、(B)溶脹率、(C)固密度(n=3)Fig.3 The moisture content , swelling rate, and tapped density of microspheres(n=3)(A)Moisture content,(B): Swelling rate,(C)Tapped density

在pH 6.8的溶液中微球12 h以上直至達到溶脹平衡，原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球(pH 6.8)的溶脹結果表明，微球A，B，C，D的溶脹率分別為105.80%，46.50%，73.62%，95.71%，見圖3B。

原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球A、B、C、D的固密度值分別是0.38、0.49、0.42、0.40 g/cm3，見圖3(C)。

2.4 體外釋放 藥物/載體比例是影響微球釋放的重要因素，由圖4可知，微球A、B、C在最初2 h內原花青素累計釋放分別為25.07%、38.83%和60.00%，沒有突釋現象。原花青素的釋放隨白芨多糖含量的增加，藥物釋放速度加快。微球C在2 h內達到60.00%，而微球A僅釋放25.07%。微球C在24 h時原花青素累計釋放67.52%，微球A、B在同一時間段內僅為28.42%、41.82%，微球C釋放比微球A、B快，這一結果表明，載體白芨多糖比例繼續增加，緩釋作用增強。微球A、B、C在48 h原花青素累計釋放量分別為28.89%、43.17%和72.86%，隨著時間的延長，微球中原花青素釋放速率降低。微球中原花青素釋放速率Microspheres A

圖4 不同藥物載體比例原花青素微球的體外釋放(PBS, pH 6.8，n=3)Fig.4 Release profile of PC microspheres of the proportion of different drug carriers at PBS (pH 6.8, n=3)

3 討論

粒子形態影響沉積性能，藥物粒子間若接觸緊密，會導致難以分離，因此要減小粒子之間的相互接觸面積，降低粒子的表面自由能[23]。Adi等[24]用不同的噴霧干燥參數制備了不同表面皺褶度的牛血清白蛋白藥物粒子，結果顯示，當皺褶度增大時，粒子之間的黏附力減小，藥物的可吸入細粉組分值增大。He等[25]已有相關文獻報道，微球表面的皺折可能是噴霧干燥過程中的條件、處方組成等多種因素造成的。Chew等[26]報道表面帶有皺折的實體圓形微球要比光滑微球具有更高的呼吸分數。褶皺性粒子提高藥物微粒可吸入性的關鍵，在于微粒的褶皺性降低了微粒與載體的相互作用力，從而減小微粒間的聚集[27]，以提高微粒的分散性和可吸入性。本實驗制備的原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球A、B、C，在噴霧干燥過程中產生的微球表面褶皺結構，一方面減少了微球之間的接觸，與表面較光滑的微球相比其粘附力降低，降低了粒子的表面自由能，另一方面具有褶皺結構的微球分散性較少依賴于吸入裝置和吸入氣流[28]。因此本實驗制作的具有表面褶皺結構的原花青素/白芨多糖/殼聚糖具有較好的沉積性能，可以考慮作為肺吸入用藥。

載體的作用多為吸附藥物粒子，提高粉霧劑的流動性。載體的粒徑、載體流動性、載體與藥物的比例對于干粉吸入劑都有重要影響。原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球的制備過程中，白芨多糖的劑量對微球特性的影響通過含水率表達。含水率又稱吸濕性，通常，吸濕增重可直接反映適度條件對粉體的影響。濕度的增加會影響離子的大小，使粉末聚集，破壞其分散性，影響藥物效果[29]，也會影響微球的霧化性能。吸濕性強的藥物以粉末形式給藥，粒子粒徑因聚集或吸收水分而增大，易于在呼吸道截留。由于白芨多糖具有一定的吸濕性，當白芨多糖載體的含量增加時，微球的吸濕性增加，所以得到的微球的吸濕率隨著白芨多糖載體的比例增加而增加。原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球C的含水率與白芨多糖/空白D微球相似，說明白芨多糖/殼聚糖微球載藥原花青素以后不影響其吸濕特性。 藥物的溶解性是影響釋放的一個重要因素，難溶的藥物釋放較慢[30]。微球A在pH6.8易于溶脹，溶脹能力的差異很可能是由于4種微球的處方組成、時間等多種因素造成，4種微球的組成處方中，微球A，B，C 3種處方白芨多糖含量不同，可能是造成這3種微球溶脹率不同的主要因素。粒子的固密度是指密實狀態下單位體積粉末的質量，也稱為粉末真密度，它表征的是粉末離子本身由于其形態特征所體現出的密度差異。空氣動力學徑是指相同沉降速度的單位密度球體的粒徑。影響粒子在呼吸道沉積的因素很多，包括沉降、擴散、慣性撞擊、截留，靜電等作用[31]，而其中沉降對粒子在肺部的沉積起主要作用。 文獻報道[32]，粒子的密度可以通過固密度估算，約為固密度的1.26倍，通過固密度以及平均粒徑的測定結果可以得出粉體的單個粒子所具有的空氣動力學徑，進而評價微球是否符合肺部粒子吸入的要求。 藥物顆粒固密度愈低，其可呼吸比例越高。結果見圖2(C)，載體比例不同，固密度值也不同(0.375～0.496)，本實驗制的微球從含水率、溶脹率、固密度3個性能來看，微球B結果最符合肺粒子吸入的要求，適合肺部吸入給藥，但還存在一些問題有待進一步解決，尤其是在處方設計和給藥裝置、體外評價方法以及長期安全性評價。

緩釋制劑是指用藥后能在較長時間內持續釋放藥物以達到延緩藥效目的的制劑。Pandey等[33]制備了利福平、異煙肼和吡嗪酰胺的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)納米粒，給藥后釋放時間長達11 d，消除半衰期和平均滯留時間顯著延長。圖3結果所示微球C藥物的釋放加快，這可能是由于隨著藥物載體含量的提高，微球膜內外的濃度差加大，導致初始速率加快。張珠[34]用加熱固化法制備利福平殼聚糖蛋白微球時發現，藥物/載體比例高或低皆可導致藥物釋放加快，要有藥物/載體比例適當，才能獲得緩釋效果。圖3結果所示，微球C同其他3種微球比較，藥物/載體比例適當，具有較好的緩釋作用，有望成為緩釋制劑進一步研究。

綜上所述，噴霧干燥法能成功地制備原花青素/白芨多糖/殼聚糖微球，得到的微球粒徑均勻、外觀圓整表面有褶皺，通過含水率、溶脹率、固密度及體外釋放等特性的分析，結果表明微球A、B、C具有較好的含水率、溶脹率、固密度，微球B結果符合肺粒子吸入的要求，但還需進一步改進，微球C具有良好的緩釋效果，原花青素/白芨多糖/殼聚糖有望研制成為肺吸入干粉制劑。

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(編校：王冬梅)

Preparation and characterization of proanthocyanidins/ bletilla striata polysaccharide/chitosan microsphere

WANG Da-wei1?, WEN Bao-fang2?, SHANG Hong-Cai3, FENG Zhan-qin4, ZHANG Wei-fen3,4Δ

(1.Department of Traditional Chinese Internal Medicine, Qushan Hospital, Linqu 262600, China; 2.Clinical College, Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 3.Beijing Chinese Medicine University, Key Laboratory of Ministry of Education of Chinese Internal Medicine, Beijing Key Laboratory of Chinese Internal Medicine,Beijing 100000, China; 4.College of Pharmacy, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo prepare proanthocyanidins/bletilla striata polysaccharide/chitosan microspheres (PC/BSP/CTS)and the physic-chemical characterizations were investigated.MethodsThe PC/BSP/CTS microspheres were prepared by spray drying method.The morphology of PC/BSP/CTS microspheres was observed by Scanning Electron Microscopy(SEM), and its physic-chemical characteristics such as diameters, release in vitro, moisture content, swelling ratio, solid density were studied.ResultsThe PC/BSP/CTS microspheres were successfully prepared by spray drying method, SEM showed that PC/BSP/CTS microspheres had the spherical shape with smooth surfaces.The diameters of microsphere A, B and C were 10～20, 2～15, 10～25 μm.The in-vitro release showed that the cumulative release of three kinds of microspheres A, B, C was 25.07 %, 38.83 % and 60.00 % in 24 h, which had no burst release, while with time prolonged to 48 h, the cumulative release was 28.89%, 43.17% and 72.86%, respectively.The results of moisture content, swelling ratio, solid density were 15.35%～23.51%, 46.50%～105.80%, 0.375～0.496.ConclusionThe PC/BSP/CTS microspheres are successfully prepared by spray drying method which possess good characteristics and sustained-release effect, which would be as a good pulmonary drug delivery system.

proanthocyanidins; bletilla striata polysaccharide; chitosan; spray drying; microshpere; physiochemical properties

國家科技部科技計劃項目(2013GA740103)；山東省自然科學基金(ZR2012CM025)；山東省科技攻關項目(2012YD 18063)；山東省濰坊市科技計劃項目(2014WS045)

王大衛，男，本科，主治醫師，研究方向：中醫內科研究，E-mail：shl20100413@sin.cn ；溫寶芳，共同第一作者，女，碩士在讀，研究方向：藥物新劑型與新技術， E-mail:wenbaofang_521@163.com；張維芬，通訊作者，女，博士，碩士生導師，教授，研究方向：藥物新劑型與新技術研究， E-mail：zwf2024@126.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)07-0133-05