生色底物法測定細胞色素C活力初探

劉莉莎，王悅，李京，李菲菲，范慧紅Δ

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京諾華制藥有限公司，上海 201210)

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生色底物法測定細胞色素C活力初探

劉莉莎1，王悅1，李京1，李菲菲2，范慧紅1Δ

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.北京諾華制藥有限公司，上海 201210)

目的 建立生色底物法測定細胞色素C活力。方法 以3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)作為底物，在37 ℃下與細胞色素C反應15 min，終止反應后生成黃色產物，在450 nm波長處測定吸光度。實驗設計采用4×4量反應平行線測定法。結果 采用生色底物法對上市細胞色素C注射劑進行活力測定，線性回歸方程為Y=0.9875X-1.0221，R2=0.9996，精密度及重復性RSD值分別為1.1 %及3.6 %。結論 生色底物法操作簡便，靈敏度高，采用相對法測活力避免了人為因素影響，初步可用于細胞色素C的活力測定。

細胞色素C；生色底物法；活力；底物；TMB

細胞色素C為細胞呼吸激活劑，屬于細胞代謝改善藥。臨床主要用于各種組織缺氧的急救或輔助治療。《中國藥典》2010年版二部中收載的細胞色素C活力測定方法為酶可還原率法[1]，即利用細胞色素C的氧化還原酶特性，通過細胞色素C可被酶還原數與被化學物質還原數的吸光度之比，以此測定其活性，該方法1948年由Paul用來測定細胞色素C活性[2]。我國自1977年《中國藥典》收載細胞色素C品種開始，一直沿用該方法測活力，至今未改變。作為傳統酶類品種，細胞色素C的活力測定方法建立之后較難改變，研究者們也嘗試著對該方法做出改進[3-6]，但仍存在一定的局限性，如新鮮的豬或牛心獲取和琥珀酸脫氫酶制備操作較繁瑣；琥珀酸脫氫酶混懸液引起吸光度的波動以及酶活力的高低均影響細胞色素C活力測定結果的準確性；有毒試劑氰化鉀的使用；為絕對法測定細胞色素C活力。

3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)在1976年被用于血紅素或含血紅素蛋白的底物檢測[7]，具有高檢測靈敏性和無致突變特性，目前已有關于細胞色素C的基礎研究使用TMB作為底物進行活性測定[8-9]。本文嘗試建立了TMB生色底物法測定細胞色素C的活力，實驗設計采用4×4量反應平行線測定法，并對上市細胞色素C注射劑進行了活力測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Molecular Devices，SpectraMax Plus384連續波長酶標儀；Mettler Toledo，XS205 Dual Range電子天平；多通道及單通道Eppendorf移液器；中國藥典生物檢定統計程序BS2000(中國食品藥品檢定研究院)。

TMB液體底物購自Sigma公司；細胞色素C標準品購自國產細胞色素C原料，按照法定標準方法自行標定活力值為100 %；細胞色素C注射劑分別購自國內3個生產企業作為供試品(廠家A、廠家B、廠家C)；其他試劑均為國產分析純。

1.2 溶液制備

1.2.1 標準品溶液：精密稱取細胞色素C標準品適量按照活力為100 %計算濃度，加水溶解并稀釋至log劑量-反應線性范圍內的4個連續濃度，一般為1.25 ～ 5.0 μg/mL，劑間比r=0.7。

1.2.2 供試品溶液：取細胞色素C注射液及注射用細胞色素C制劑，分別按照預估活力為100 %計算濃度，加水稀釋至與標準品溶液相同的4個濃度。

1.2.3 1.0 mol/L硫酸溶液：量取硫酸12.0 mL，加水稀釋至200 mL。

1.2.4 空白輔料溶液：稱取雙甘氨肽80 mg，亞硫酸鈉13.3 mg，亞硫酸氫鈉13.3 mg，加水溶解混勻并稀釋至100 mL。

1.3 活力測定 在96孔酶標板上加樣，分別為4個濃度的標準品(S1、S2、S3、S4)和供試品(T1、T2、T3、T4)，每個濃度平行做2孔，按照S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的順序加樣，加樣量10 μL。在每個加樣孔中加入TMB液體底物100 μL，置于酶標儀中混勻，避光，37 ℃保溫15 min。取出，每孔加入1.0 mol/L硫酸溶液100 μL終止反應。在450 nm波長處測定每孔的吸光度值。以吸光度對數值為縱坐標，標準品或供試品溶液濃度對數值為橫坐標分別作線性回歸，按生物檢定統計法中的量反應平行線原理4 × 4法實驗設計，回歸項應非常顯著(P<0.01)，偏離平行、二次曲線、反向二次曲線各項均應不顯著(P>0.05)，可信限率(FL%)不大于10 %，可靠性測驗結果通過后，計算細胞色素C供試品溶液濃度，進而計算實際活力。

1.4 專屬性 按照1.2項下方法分別配制4個連續濃度的標準品溶液及供試品溶液，同時配制輔料溶液和4個相應濃度的牛血清白蛋白溶液，量取上述溶液各10 μL加入酶標板，按照1.3項下方法測定反應后的吸光度值。

1.5 線性 精密稱取細胞色素C標準品適量，加水制成濃度為0.2 mg/mL的溶液，量取上述溶液1000、750、625、500、375、250、125、62.5μl分別置于10 mL容量瓶內，加水稀釋至刻度并混勻，得到濃度依次為20.0、15.0、12.5、10.0、7.5、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列線性溶液。分別量取上述溶液各10 μL，按照1.3項下方法測定反應后的吸光度值，以吸光度對數值為縱坐標，溶液濃度對數值為橫坐標，進行線性回歸。

1.6 精密度及重復性 按照1.2項下方法分別配制4個連續濃度的標準品溶液及相應濃度的供試品溶液，按照1.3項下方法測定吸光度，連續測定6次，計算活力的RSD值。

按照1.2項下方法，配制連續濃度的標準品溶液，另取同一批號的供試品6份，分別配制連續濃度的供試品溶液，按照1.3項下方法測定吸光度，計算6份供試品溶液活力的RSD值。

2 結果

2.1 專屬性 按照1.4項下方法測得的結果見表1。標準品溶液和供試品溶液吸光度值均隨著濃度的增加而增大，而輔料溶液和不含有細胞色素C的牛血清白蛋白溶液吸光度值幾乎無變化，說明反應液中只有細胞色素C可以與底物發生生色反應，而其他物質不發生反應。

表1 專屬性試驗吸光度結果Tab.1 Results of absorbance by the specificity test

2.2 線性 按照1.5項下方法得到線性回歸方程為Y=0.9875X-1.0221，R2=0.9996。結果顯示該方法細胞色素C溶液濃度在1.25～20.0 μg/mL范圍內線性良好。

2.3 精密度及重復性 按照1.6項下方法計算RSD值分別為1.1 %及3.6 %，結果顯示該方法精密度及重復性較好。

2.4 供試品活力測定結果 按照1.3項下方法對8批供試品的活力進行測定，在可靠性測驗結果通過后，計算活力，結果見表2，同時與藥典方法測得活力結果進行比較，結果顯示生色底物法比藥典方法測得結果普遍偏高。

表2 供試品活力測定結果Tab.2 Results of activity assay

3 討論

3.1 原理 細胞色素C是三羧酸循環中非常重要的電子傳遞體，它通過鐵卟啉輔基中鐵原子價態轉變將電子由細胞色素還原酶傳遞給細胞色素氧化酶，引起氧化還原反應。作為氧化還原酶，細胞色素C可與底物TMB反應生成亞胺絡合物，產物具有紫外吸收，且吸光度值與細胞色素C濃度成正比，通過測定反應產物的吸光度，進而測定細胞色素C的活力。藥物對生物體所引起的反應隨著藥物劑量的增加產生的量變可以測量者，稱為量反應[10]。根據量反應平行線測定法的原理及方法[11-14]，測定細胞色素C活力。

3.2 底物及檢測波長的確立 考察了TMB和鄰苯二胺兩種底物用于測定細胞色素C的活力，發現鄰苯二胺需要新鮮配制，放置過程極不穩定，易氧化使溶液顯黃色，影響吸光度測定的準確性和重現性，誤差較大。而TMB是市售并且按照統一配方配制而成，較為穩定。考慮到方法重現性和底物穩定性，選擇TMB作為反應底物。由于TMB在細胞色素C作用下生成亞胺絡合物，在450 nm波長處有最大吸收，故檢測波長為450 nm。

3.3 濃度及劑間比的確立 通過2.2線性考察結果，細胞色素C溶液濃度在1.25～20.0 μg/mL范圍內線性良好，考慮到紫外檢測的準確性，選擇反應吸光度值為0.2～1.0的溶液，對應濃度范圍為1.25～5.0 μg/mL。

量反應平行線原理劑間比r=1.2 ～ 2.0，在此基礎上比較劑間比分別為r=0.8、r=0.7、r=0.6和r=0.5時的反應吸光度，發現劑間比為r=0.8時，吸光度值雖然在0.2～1.0范圍內，但是濃度的線性范圍較窄，而劑間比為r=0.5和r=0.6時，濃度的線性范圍雖然較寬但反應吸光度最低值均小于0.1，系統誤差較大。因此，綜合比較，劑間比為r=0.7時，較為合適。最終配制的溶液濃度為5.0、3.5、2.45、1.715 μg/mL。

3.4 反應時間的確立 考察了不同反應時間(5、10、15、20 min)測定的吸光度。發現5 min時反應不完全，加入終止液后吸光度值仍波動較大。當反應時間為10、15、20 min時加入終止液，測得吸光度值較為穩定，綜合考慮反應的充分性及時間成本，選擇中間時間15 min作為反應時間。

3.5 與藥典方法比較 本研究嘗試建立的TMB生色底物法采用標準品及量反應平行線原理檢測細胞色素C的相對活力，并應用于制劑的檢測，該方法排除了人為因素的影響；通過交叉加樣順序，避免了由加樣順序引起的誤差；采用平行線原理計算4種梯度濃度的細胞色素C活力，而不是測定單一濃度的活力，結果更為全面可靠；計算所得幾項參數(回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線的P值)能夠表征結果的準確性和可靠性。但由于TMB底物法對含有血紅素的蛋白酶類均可以進行活性測定，因此對于細胞色素C原料及其制劑需在進行理化鑒別及紫外特征吸收峰鑒別符合規定后進行TMB生色底物法的活力測定。通過與藥典方法測得的結果比較(見表2)，可以看出，生色底物法測得的結果比藥典方法測得的結果普遍偏高，這可能與標準品標化為本實驗室內部自行標定，未進行更合理的協作標定而導致標準品的標示量不夠精確有關。

綜上所述，本研究嘗試建立了生色底物法測定細胞色素C活力，并采用該方法對上市的細胞色素C注射劑進行了活力測定。該方法操作簡便、快速，靈敏度高，減少了人為因素的影響，避免了有毒試劑的使用，可用于細胞色素C活力測定。方法的影響因素及結果可靠性還需要進一步研究驗證。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2010年版.北京: 化學工業出版社, 2010: 附錄Ⅻ B.

[2] Paul KG.The stability of dried cytochrome C [J].Acta Chem Scand, 1948, 2: 557-560.

[3] 楊賢亭, 程淑坤, 王力, 等.供試品溶液制備時間對細胞色素C活力的影響[J].生化藥物雜志, 1988, 3: 24-25.

[4] 張元亮, 王云山.琥珀酸脫氫酶對細胞色素C活力測定的影響[J].中國醫藥工業雜志, 1994, 25(8): 354-381.

[5] 張元亮, 王云山.細胞色素C活力測定方法討論[J].中國生化藥物雜志, 1994, 15(1): 59-61.

[6] 魏廉征.細胞色素C活力測定探討[J].臟器生化制藥, 1980, 3: 32-33.

[7] Paul ET, Dene R, Wayne L.An improved staining procedure for the detection of the peroxidase activity of cytochrome P-450 on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels [J].Anal Biochem, 1976, 75(1): 168-176.

[8] 蔡華偉, 萬琳, 楊浩, 等.人源細胞色素C在大腸桿菌中的重組表達和分離純化[J].生物醫學工程學雜志, 2007, 24(3): 620-625.

[9] 黃以.蛋白質-血紅素復合物過氧化物酶活性及其催化蛋白質氧化和酪氨酸硝化作用研究[D].華中科技大學, 2014.

[10] 李任強, 陳瑤, 江鳳儀, 等.微量動力學分光光度法檢測細胞色素C制品的品質[J].分析科學學報, 2005, 21(4): 463-464.

[11] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2010年版.北京: 化學工業出版社, 2010: 附錄ⅩⅣ.

[12] EP[S].7.0.2011: 2152.

[13] USP[S].35.2012: 3040.

[14] 李京, 范慧紅.微量生色底物法測定肝素鈉抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性[J].中國生化藥物雜志, 2010, 31(1): 45-47.

(編校：王冬梅)

Determination of the activity of cytochrome C by the chromogenic substrate method

LIU Li-sha1, WANG Yue1, LI Jing1, LI Fei-fei2, FAN Hui-hong1Δ

(1.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 2.Beijing Novartis Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201210, China)

ObjectiveTo establish the chromogenic substrate method to determine the activity of cytochrome C.MethodsUsed TMB as the chromogenic substrate, reacted at 37 ℃ for 15 min, generated the yellow products, and detected the absorbance at 450 nm.The experimental design method is the 4×4 parallel line quantitative analysis.ResultsThe activities of cytochrome C injection samples have been determined.The linear regression equation was Y=0.9875 X - 1.0221，R2=0.9996.The accuracy and repeatability were 1.1 % and 3.6 %.ConclusionThe chromogenic substrate method was simple operation, sensitive and can be used to determine the activity of cytochrome C.

cytochrome C; chromogenic substrate method; activity; substrate; TMB

劉莉莎，女，碩士，主管藥師，研究方向：酶類生化藥物質量控制，E-mail：Jzllisha@163.com范慧紅，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥物質量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

R719

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1005-1678(2015)07-0138-03