多指標綜合評分法優選清熱解毒口服液的提取工藝

高天曙，王會麗，趙義紅

(1.河南省中醫院 藥學部，河南 鄭州 450004；2.河南省中醫藥研究院 肝膽脾胃科，河南 鄭州 450004；3.河南省中醫藥研究院附屬醫院 趙國岑名醫工作室，河南 鄭州 450000)

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多指標綜合評分法優選清熱解毒口服液的提取工藝

高天曙1，王會麗2，趙義紅3

(1.河南省中醫院 藥學部，河南 鄭州 450004；2.河南省中醫藥研究院 肝膽脾胃科，河南 鄭州 450004；3.河南省中醫藥研究院附屬醫院 趙國岑名醫工作室，河南 鄭州 450000)

目的 優選清熱解毒口服液最佳提取工藝。方法 以加水量、提取時間、提取次數和含醇百分率為考察因素，每因素設計3個水平，以黃芩苷、綠原酸和梔子苷轉移率及浸膏得率為指標，進行加權綜合評價， 用L9(34) 正交表安排試驗。結果 清熱解毒口服液最佳的提取工藝為加8倍量水提取3次，每次1h，含醇百分率為70%。結論 驗證試驗表明通過正交試驗得到的清熱解毒口服液提取工藝設計合理，結果可靠，提取效果較好，具有較高的應用價值。

多指標綜合評分；清熱解毒口服液；正交試驗；提取工藝

清熱解毒口服液由金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子等12味中藥組成，收載于衛生部藥品標準中藥成方制劑第七冊[1]，方中重用石膏清熱瀉火，生津止渴為君藥；梔子、黃芩、龍膽清熱瀉火，雙花、連翹、甜地丁、板藍根清熱解毒，玄參、生地黃清熱涼血，諸藥均助君藥清熱瀉火解毒為臣藥；知母、麥冬清熱生津為佐藥，有清熱解毒、生津止渴等功效。本文采用L9(34) 正交試驗表，以加水量、提取時間、提取次數和含醇百分率為考察因素[2-3]，以黃芩苷、綠原酸和梔子苷3者的含量為綜合評價指標對其提取工藝進行了優選研究，以期為臨床合理應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品 處方藥材(江蘇省醫藥公司)，經鑒定均符合《中國藥典》2010年版一部的相關標準；黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201016)；綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314)；梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-201316)。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括1525溶液輸送泵、2487紫外可變波長檢測器; Breeze工作站(購自Waters公司)；JK-5200型超聲波清洗器(購自合肥金尼克機械制造有限公司)；XS205DU電子天平(購自梅特勒有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純(Fisher公司)，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率的測定[2]：將按正交試驗得到的各樣品提取液分別轉移至1000 mL量瓶中，加水定容，各精密量取20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣于105 ℃干燥至恒重，放冷至室溫后稱重，計算浸膏得率。

1.3.2 黃芩的含量測定：① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相：甲醇-水-磷酸(50︰50 ︰0.3)；檢測波長：276 nm；柱溫：室溫。

② 對照品溶液的制備： 精密稱取黃芩苷對照品(五氧化二磷減壓干燥至恒重)加70%乙醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

③ 供試品溶液的制備： 精密量取按正交試驗得到的各樣品提取液2 mL，置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量，振搖，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

④ 陰性樣品溶液的制備：按照清熱解毒口服液的處方制備不含黃芩的樣品，按照③項下的方法操作，制成陰性樣品溶液。

⑤ 線性關系的考察：精密稱取黃芩苷對照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含黃芩苷50 μg的溶液，精密吸取上述對照品溶液2、8、10、12、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分別加70%乙醇定容至刻度，搖勻，制得不同濃度的對照品溶液。取上述對照品溶液，按照1.3.2 項下①色譜條件分別進樣10 μL 分析，記錄峰面積。

⑥ 精密度實驗：精密量取黃芩苷對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復進樣6次，記錄峰面積。

⑦ 穩定性實驗：精密吸取同一黃芩苷對照品溶液10 μL，室溫放置，分別在0、2、4、 6、 8、24 h進樣，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩定性。

⑧ 加樣回收率實驗：精密量取已知含量的樣品提取液2 mL，共6份，分別置100 mL量瓶中，各精密加入適量的黃芩苷對照品溶液，加70%乙醇適量，振搖，濾過，取續濾液即得，精密量取上述溶液10 μL，分別進樣，測定并計算回收率(以黃芩苷計)。

1.3.3 金銀花的含量測定：

① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87)；檢測波長：325 nm；柱溫：室溫。

② 對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL中含綠原酸20 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

③ 供試品溶液的制備：精密量取按正交試驗得到的各樣品提取液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

④ 陰性樣品溶液：按照清熱解毒口服液的處方制備不含金銀花的樣品，照③項下的方法操作，制成陰性樣品溶液。

⑤ 線性關系的考察：精密稱取綠原酸對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含綠原酸100 μg的溶液，精密吸取上述對照品溶液2、8、10、12、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分別加50%甲醇定容至刻度，搖勻，制得不同濃度的對照品溶液。取上述對照品溶液，按照1.3.3 項下①色譜條件分別進樣10 μL 分析, 記錄峰面積。

⑥ 精密度實驗：精密量取綠原酸對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復進樣6次，記錄峰面積。

⑦ 穩定性實驗：精密吸取同一綠原酸對照品溶液10 μL，室溫放置，分別在0、 2、 4、 6、 8、 24 h進樣，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩定性。

⑧ 加樣回收率實驗：精密量取已知含量的樣品提取液1 mL，共6份，分別置25 mL量瓶中，各精密加入適量的綠原酸對照品溶液，加50%甲醇適量，振搖，濾過，取續濾液即得，精密量取上述溶液10 μL，分別進樣，測定并計算回收率。

1.3.4 梔子的含量測定：

① 色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相 ：乙腈-水(12︰88)；檢測波長：238 nm；柱溫：室溫。

② 對照品溶液：精密稱取梔子苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

③ 供試品溶液：精密量取按正交試驗得到的各樣品提取液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

④ 陰性樣品溶液：按照清熱解毒口服液的處方制備不含梔子的樣品，按照1.3.4項下②的方法操作，制成陰性樣品溶液。

⑤ 線性關系的考察：精密稱取梔子苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含梔子苷250 μg的溶液，精密吸取上述對照品溶液2、8、10、15、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分別加50%甲醇定容至刻度，搖勻，制得不同濃度的對照品溶液。取上述對照品溶液，按1.3.4 項下①色譜條件分別進樣10 μL分析, 記錄峰面積。

⑥ 精密度實驗：精密量取梔子苷對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復進樣6次。

⑦ 穩定性實驗：精密吸取同一梔子苷對照品溶液10 μL，室溫放置，分別在0、2、4、6、 8、24 h進樣，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩定性。

⑧ 加樣回收率實驗：精密量取已知含量的樣品提取液1 mL，共6份，分別置25 mL量瓶中，各精密加入適量的梔子苷對照品溶液，加50%甲醇適量，振搖，濾過，取續濾液即得，精密量取上述溶液10 μL，分別進樣，測定并計算回收率。

1. 3 樣品含量測定 分別精密量取正交試驗項下1～9號樣品溶液各10 μL，分別按照“1.3.2”“1.3.3”及“1.3.4”項下①色譜條件進樣，測定各成分峰面積。

1.4 正交試驗優選提取工藝 根據生產工藝并結合處方中各藥材的理化性質來選擇考察因素，預實驗表明，浸泡時間(浸泡1h即可)對提取效果的影響很小，故本實驗選擇對提取效果影響較大的加水量、提取時間、提取次數和含醇百分率4個因素進行優化，每因素設計3個水平，以黃芩苷、綠原酸和梔子苷轉移率及浸膏得率為指標，進行加權綜合評價，因素水平表選擇L9(34) 正交表，見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factor and level of orthogonal design

1.5 正交試驗方法[4]按處方比例稱取9個處方量的金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子等十二味藥材，先溫浸1 h，分別按正交試驗設計進行煎煮(待沸騰后，稍冷加金銀花和黃芩)，濾過，合并濾液，濾液濃縮至相對密度為1.17，最后加入一定量的乙醇，按正交試驗設計進行提取，各提取液均冷藏48 h，濾過，回收乙醇，加入0.5%的活性碳，加熱30 min，濾過，濾液加水至1000 mL，定容，備用。

2 結果

2.1 黃芩的含量測定

2.1.1 黃芩苷的線性方程：以平均峰面積(A)為縱坐標Y，進樣的質量濃度(mg/L)為橫坐標X，進行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程Y=5.01×105+4.35×103(r=0.9993)，由結果可知，黃芩苷的線性范圍為2～25 mg/L 。

2.1.2 精密度實驗：黃芩苷峰面積的RSD為1.56%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩定性實驗：黃芩苷峰面積的RSD為1.7 8%，表明黃芩苷對照品溶液在24 h內基本穩定。

2.1.4 加樣回收率實驗：結果測得黃芩苷的平均回收率為100.28%，RSD=1.79%(n=6)。

2.2 金銀花的含量測定

2.2.1 綠原酸的線性方程：以平均峰面積(A)為縱坐標Y，進樣的質量濃度(mg/L)為橫坐標X，進行線性回歸，得綠原酸的回歸方程Y=6.37×105-7.03×104(r=0.9996)，由結果可知，綠原酸的線性范圍為4～50 mg/L 。

2.2.2 精密度實驗：綠原酸峰面積的RSD為1.61%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性實驗：綠原酸峰面積的RSD為2.19%，表明綠原酸對照品溶液在24 h內基本穩定。

2.2.4 加樣回收率實驗：結果測得綠原酸的平均回收率為97.82%，RSD=2.21%(n=6)。

2.3 梔子的含量測定

2.3.1 綠原酸的線性方程：以平均峰面積(A)為縱坐標Y，進樣的質量濃度(mg/L)為橫坐標X，進行線性回歸，得梔子苷的回歸方程Y=5.73×104-3.79×103(r=0.9997)，由結果可知，梔子苷的線性范圍為10～125 mg/L。

2.3.2 精密度實驗：梔子苷峰面積的RSD為1.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性實驗：梔子苷峰面積的RSD為1.57%，表明梔子苷對照品溶液在24 h內基本穩定。

2.3.4 加樣回收率實驗：結果測得梔子苷的平均回收率為99.73%，RSD=1.62(n=6)。

2.4 正交試驗結果 正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果Tab.2 Results of the orthogonal )

注：綜合評分=0.4×W黃芩苷量/WMax黃芩苷量+0.2×W綠原酸量/WMax綠原酸量+0.3×W梔子苷量/WMax梔子苷量-0.1×W浸膏得率/WMax浸膏得率

本實驗對正交試驗的結果進行了加權綜合評分分析，加權綜合評分[5-8], 是指運用數學方法對復雜體系中的多個指標信息進行分析處理，根據復雜體系中各指標信息的貢獻大小給予它們不同的權重系數。根據清熱解毒口服液的處方及其質量標準中對各主要成分的含量規定來分配權重系數，即黃芩苷0.4，綠原酸0.2，梔子苷0.3，浸膏0.1。因為本制劑為口服液，浸膏越少，澄明度及穩定性越好，所以浸膏得率為負向指標，其余3項均為正項指標。

表3 方差分析表Tab.3 Table of variance analysis

由以上表格直觀分析可知，對于黃芩苷，各因素影響程度的大小為：C>A>D>B，對于綠原酸，各因素影響程度的大小為：C>D>A>B，對于梔子苷，各因素影響程度的大小為：C>A>B>D，對于負向指標浸膏得率，各因素影響程度的大小為：C>D>B>A，對各影響因素加權后綜合評分分析，各因素順序為：C>D>A>B，即提取次數對提取效果的影響是最大的，其次是含醇量和加水量，最后是提取時間。可見，在提取次數滿足一定要求后，提取時間對提取效果的影響不是很明顯；另外，加水量和含醇量是藥材中有效成分能提取完全的前提，本提取方法采用的是“水提醇沉”工藝，包含水溶性有效成分的充分溶出和雜質的過濾，含水量和含醇量對于本工藝來說是兩個非常重要的指標。

下面分析各影響因素指標在各水平的排列順序：

黃芩苷：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1;

綠原酸: A1>A3>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1;

梔子苷：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D2>D3>D1;

浸膏：A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D1>D2>D3;

加權綜合評分：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1。

2.5 正交試驗優選結果 經直觀分析和方差分析并結合實際生產工藝的情況，得出選清熱解毒口服液最佳提取工藝為A2B2C3D3，即加8倍量的水提取3次，每次1h，然后加入乙醇精提，使含醇量達到70%。

2.6 驗證試驗 按處方組成比例稱取3份藥材，采用優選的提取工藝進行驗證試驗，測定結果見表4。

表4 優選工藝驗證結果(n=3，%)Tab.4 Validation results of the optimized test (n=3,%)

3 討論

由于綠原酸是熱不穩定性化合物[9]，不宜長時間加熱，而通過正交試驗設計發現，提取次數對提取效果的影響是最大的，在提取次數滿足一定要求時，提取時間對提取效果的影響不是很明顯，因此在選擇提取時間上，本研究選擇了B2，即1 h,這個結果與以往綠原酸的提取時間吻合[10-11]。

本處方提取采用的是“水提醇沉”工藝[12-14]，“水提醇沉”工藝法是常用于中藥水提取液的純化精制方法，藥材先經水煎提取，其中生物堿、有機酸鹽、氨基酸類等水溶性有效成分被提取出來，同時也浸提出很多水溶性雜質，然后在提取液中加入一定量的乙醇，利用有效成分能溶于乙醇而雜質不溶于乙醇的特性，將有效成分轉溶于乙醇中而使雜質沉淀出來。“水提醇沉”的第一個前提是加水量，加水量對藥材中有效成分的充分溶出有很大的影響，而含醇量則是將有效成分進行精提的關鍵，含醇量過多，藥材中有效成分損失嚴重；含醇量太低則會導致雜質過多。

綜上所述，通過正交試驗優化設計，選擇了加8倍量的水提取3次，每次1h，然后加入乙醇精提，使含醇量達到70%。

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(編校：王冬梅)

Optimize the extraction process of Qingrejiedu oral liquid by multi-index comprehensive evaluation

GAO Tian-shu1, WANG Hui-li2, ZHAO Yi-hong3

(1.Department of Pharmacy, Henan Traditional Chinese Medicine Hospital, zhengzhou 450004, China; 2.Department of Liver and Spleen, Henan Chinese Medicine Research Institute,zhengzhou 45000, China; 3. Doctor Zhao Guocen Studio, Affiliated Hospital of Henan Chinese Medicine Research Institute, zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo optimize the extraction techique for Qingrejiedu oral liquid.MethodsThe amount of water, extraction time , extraction times and alcohol content were used as inspection factor, 3 levels per factor, with baicalin, chlorogenic acid , geniposide transfer rate and extraction rate as indexes,carries on Weighted comprehensive evaluation,the optimal extractin were screened by L9(34) orthogonal test.ResultsThe optimal extraction condition of Qingrejiedu oral liquid were as follow:extraction for 3 times and 1h each time with 8-fold amount of water and 70% alcohol.ConclusionThrough the orthogonal test, the extraction process of Qingrejiedu oral liquid is designed reasonably, the result is reliable, and the extraction effect is good, and has higher application value.

multi-index comprehensive evaluation; Qingrejiedu oral liquid; orthogonal test; extraction process

高天曙，男，本科，主管藥師，研究方向: 中藥藥理與中藥臨床研究，E-mail： 3157797926@qq.com。

R969.3

B

1005-1678(2015)07-0141-04