表面增強拉曼光譜結合乘子效應模型對血漿和藥片中甲巰咪唑的定量檢測

胡敏　陳增萍 陳瑤　石彩霞　俞汝勤

摘 要 將表面增強拉曼散射（Surface-enhanced raman scattering，SERS）技術與乘子效應模型結合，采用2-巰基異煙酸作為內標，以銀納米顆粒為SERS增強基底，對血漿和藥片樣本中甲巰咪唑的進行準確的定量分析。實驗結果表明，本方法對血漿樣本中甲巰咪唑的平均相對預測誤差為5.1%，檢出限為32 nmol/L；對藥片中甲巰咪唑的定量結果與LC-MS/MS方法基本一致，其加標回收率在93.3%～110.9%之間。

關鍵詞 表面增強拉曼光譜； 甲巰咪唑； 2-巰基異煙酸； 乘子效應模型； 定量分析

1 引 言

甲巰咪唑為抗甲狀腺藥物，一般用于各種類型的甲狀腺功能亢進癥【1，2】的治療。但該藥物的使用不當或者過量使用會產生一定的副作用，輕則出現粒細胞減少，脫發、皮炎等，重則可能導致中毒性肝損傷。因此，必須在甲巰咪唑的生產和使用過程進行嚴格的定量監控。目前，甲巰咪唑的定量分析方法有液相色譜法【3，4】、氣相色譜-質譜法【5，6】、電化學方法【7，8】和間接流動注射法【9】等。但是，這些方法均具有一定的局限性：需要對復雜實際樣品進行繁瑣費時的預處理，或者所需儀器價格昂貴且體積龐大，不適用于大量樣品的快速在線分析。因此， 建立一種新型簡便、快速、靈敏的甲巰咪唑的定量方法仍具有較重要的現實意義。

表面增強拉曼散射技術（Surface-enhanced raman scattering，SERS）具有光譜特征性強、靈敏度高、制樣簡單，以及檢測快捷等優點【10～15】。但是，樣本的SERS信號強度不但取決于待測樣本中待測物質的濃度，而且與SERS增強基底物理性質（如納米銀或金膠體的形狀、粒徑以及聚集度等）有關。而常用SERS增強基底銀（金）納米溶膠的可重現性和穩定性均較差，嚴重影響樣本SERS信號的重現性，導致SERS定量分析結果的精確度遠遠不到實際定量分析的要求。最近，本研究小組發展了一個適用于表面增強拉曼光譜定量分析的乘子效應模型（Multiplicative effects model for surface-enhanced raman spectroscopy， MEMSERS）【16，17】。 MEMSERS模型能夠有效消除SERS增強基底物理性質變化對SERS定量分析結果準確度的影響。本研究將SERS技術與MEMSERS相結合，實現了血漿和藥片中甲巰咪唑含量的快速準確定量分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

便攜式i-拉曼785H光譜儀（上海必達泰克光電科技有限公司）；1290液相色譜/G6460B系列三級四極桿質譜聯用儀（安捷倫科技有限公司）；C18反相色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm）。

二水合檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）和AgNO3（Sigma-Aldrich 試劑有限公司）。正常人血漿從雙流正龍生化制品研究室（長沙）獲得。甲巰咪唑和2-巰基異煙酸（阿拉丁公司）。甲巰咪唑藥片（北京燕京藥業有限公司）。實驗用水均為超純水（18.2 MΩ cm），直接從艾科浦純水系統（艾科浦公司）中取用。所有試劑均為分析純。

2.2 SERS增強基底銀納米顆粒的制備

實驗中所用玻璃器皿均在王水（HCl-HNO3， 3∶1， V/V）中浸泡8 h以上，用超純水沖洗，烘干后使用。本研究中所用銀納米溶膠是按照Lee-Meisel方法【18】制備：稱取18 mg AgNO3， 用水溶解并定容至100 mL；將此溶液轉至圓底燒瓶并加熱至沸騰后，迅速加入2 mL檸檬酸三鈉溶液（1%），保持沸騰并繼續回流1 h后停止加熱，使溶液自然冷卻至室溫，裝瓶待用。

2.3 樣品的制備

分別用超純水和乙醇溶解適量的甲巰咪唑和2-巰基異煙酸，得到5.50 mmol/L甲巰咪唑儲備液和0.31 mmol/L 2-巰基異煙酸儲備液，于4 ℃保存備用。移取10 μL 2-巰基異煙酸儲備液和不同體積的甲巰咪唑儲備液，用水稀釋至0.50 mL，得到11個甲巰咪唑校正樣本，其中甲巰咪唑的濃度分別為0.06， 0.18， 0.37， 0.55， 0.73， 0.92， 1.10， 1.28， 1.47， 1.65和1.83 μmol/L。

移取1.00 mL正常人血漿（用LC-MS/MS沒有檢測出甲巰咪唑）于10.0 mL離心管中，用乙腈稀釋至8.0 mL，于20 ℃以10000 r/min離心20min； 吸取4.00 mL 上清液，定容至50.0 mL，備用。移取10 μL 2-巰基異煙酸儲備液與適量甲巰咪唑儲備液，用上述血漿上清液稀釋至0.5 mL，得到甲巰咪唑濃度分別為0.28， 0.46， 0.83， 1.01， 1.19， 1.38和1.74 μmol/L的血漿預測樣本（對每個甲巰咪唑濃度水平，均配制3個重復血漿樣本）。

準確稱取一片甲巰咪唑藥片（0.0721 g），用水溶解并定容至50.0 mL，再以水將其稀釋50倍，得到甲巰咪唑藥片儲備液。如表1所示，將20 μL藥片儲備液與10 μL 2-巰基異煙酸儲備液和適量甲巰咪唑儲備液混合后用超純水稀釋至0.5 mL，得到藥片預測集樣本。

2.4 樣本SERS光譜的采集

將10 μL樣本、50 μL的銀納米顆粒（AgNPs）、以及2.5 μL 2 mol/L KCl混勻后，立即用毛細管取樣，使用耦合了BAC151A拉曼影像顯微鏡采樣系統的便攜式i-Raman 785H光譜儀采集其SERS光譜。樣本SERS光譜采集參數如下：拉曼位移范圍500～1600 cm

激光波長785 nm，激光功率300 mW，物鏡倍數20倍，曝光時間5 s。每個樣品均重復測量3次。

2.5 LC-MS/MS實驗endprint

為了驗證SERS 技術結合MEMSERS模型對藥片預測集樣本中甲巰咪唑含量預測結果的準確性，本研究采用1290液相色譜/G6460B系列三級四極桿質譜聯用儀對藥片預測集中的9個樣本中甲巰咪唑的含量進行了檢測。每個樣本均重復檢測3次。具體的色譜與質譜實驗條件如下： C18反相色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm），流動相為0.1%甲酸-甲醇（1∶1，V/V），流速0.3 mL/min，進樣量20 μL，質譜離子源：電噴霧離子源，檢測模式：正離子多重反應監測模式，母離子：m/z 115.0 （其最優電壓值為102 V），子離子：m/z 57.2和88.0 （其最優的碰撞電壓分別為18和15 V），掃描時間：300 ms。表1 藥片預測樣本的實驗設計范圍內的SERS光譜數據進行后續的定量分析。

由于樣本的SERS光譜信號強度除了與待測分析物濃度有關之外，還會受SERS增強基底（如銀納米顆粒）物理性質變化的影響，這使得樣本的SERS光譜信號強度與待測分析物的濃度之間的關系常不為簡單的線性關系。本研究采用如下MEMSERS模型對甲巰咪唑樣本的表面增強拉曼光譜進行定量分析。

xk=bk·（c2-MNA，k·r2-NMA+cMMI，k·rMMI）+dk k=1，2，......K（1）

其中，xk代表第k個校正樣本的SERS光譜；c2-MNA， k和cMMI， k分別代表第k個校正樣本中2-巰基異煙酸和甲巰咪唑的濃度；r2-MNA和rMMI分別代表2-巰基異煙酸和甲巰咪唑分子的拉曼散射特性；乘子參數bk代表SERS增強基底物理性質等因素變化對第k個校正樣本的SERS光譜信號產生的乘子效應；dk代表背景干擾和SERS增強基底物理性質變化對第k個校正樣本SERS光譜信號產生的非乘子效應。由于內標物2-巰基異煙酸在每個樣本中的濃度c2-MNA， k是固定不變的，因此MEMSERS模型中校正樣本的乘子參數bk（k=1， 2， …， K）可以用改進光程估計與糾正的方法（Modified optical path length estimation and correction， OPLECm）【17】估計出來。獲得乘子參數bk（k=1， 2， …， K）后，采用多元校正方法（如Partial least squares regression， PLSR）在xk與bk之間，以及xk與bk·cMMI，k之間建立兩個校正模型。獲得待測樣本的SERS光譜xtest后，待測樣本中甲巰咪唑的濃度可以由第二個校正模型的預測值除以第一個校正模型的預測值而獲得。

本研究將用水配制的甲巰咪唑校正集樣本的SERS光譜作為校正集，在其上建立MEMSERS和PLSR校正模型，然后將所建立的MEMSERS和PLSR校正模型用于預測血漿預測集樣本和藥片預測集樣本中甲巰咪唑的濃度。MEMSERS和PLSR校正模型中使用的最優潛變量數均采用交互驗證法確定。采用預測均方根誤差（RMSEP）：

RMSEP=Nk=1（cMMI，k-MMI，k）2/N（2）

cMMI， k和MMI， k分別代表第k個待測樣本中甲巰咪唑的真實濃度和預測濃度；N代表待測樣本的數目）。平均相對預測誤差（ARPE）：

ARPE=1NNi=1（cMMI，k-MMI，k）/cMMI，k×100%（3）

采用RMSEP和ARPE評價和比較MEMSERS與PLSR校正模型的預測結果。

3 結果與討論

3.1 內標濃度的優化

采用內標加入法對待測樣本中的甲巰咪唑進行SERS定量分析。內標物2-巰基異煙酸（其SERS特征峰數量少且信號較強）和待測分析物2-巰基異煙酸均含有巰基，它們可通過與銀納米顆粒表面形成穩定的AgS鍵而修飾在銀納米顆粒表面。由于甲巰咪唑與2-巰基異煙酸之間可能存在對銀納米顆粒表面上結合位點的競爭現象，作為內標物加入的2-巰基異煙酸的濃度若太低，則其SERS信號太弱，起不到內標作用；但2-巰基異煙酸濃度也不能太高，否則會影響甲巰咪唑的檢測靈敏度。為了實現對本研究所考察濃度范圍內的甲巰咪唑進行較準確的定量分析，將所加入的2-巰基異煙酸的濃度設置為一個比較適中的值，即6.2 μmol/L。

3.2 增強基底物理物質對樣本SERS光譜信號的影響

在SERS定量分析過程中遇到的最大問題是：樣本的SERS光譜信號重現性較差。如圖2所示，在其它實驗條件完全一樣的情況下，將激光聚焦在同一根取樣毛細管（毛細管中裝有同一銀納米顆粒-KCl-樣本混合物）中不同位置所獲得一組SERS光譜之間存在明顯差異。這主要是由SERS增強基底納米銀顆粒的形狀和大小分布不均勻所致。由OPLECm所估計出來的甲巰咪唑校正集樣本的乘子參數bk在1.0～2.6范圍內變動，表明SERS增強基底納米銀顆粒的形狀和大小分布不均勻性對樣本SERS光譜信號有很大影響。必須采取措施消除這種不利影響，才能實現對血漿預測集樣本和藥片預測集樣本中甲巰咪唑的準確定量分析。

3.3 樣品分析

3.3.1 血漿樣本中甲巰咪唑的定量分析 將建立在用水配制的甲巰咪唑校正集樣本SERS光譜數據上的MEMSERS和PLSR校正模型應用于血漿預測集樣本中甲巰咪唑濃度的定量分析。如表2所示，PLSR模型的RMSEP和ARPE值分別為0.13 μmol/L和11.0%。PLSR模型預測值與實際值之間的偏差相對較大。此外，PLSR模型對同一樣本的3次重復測量SERS光譜的定量分析結果的標準方差較大。這些現象表明， PLSR模型不能有效消除SERS增強基底物理性質的不均一性對SERS定量分析結果的不利影響。相比之下，MEMSERS模型給出的甲巰咪唑濃度的預測值與實際值非常接近，而且其對同一樣本的3次重復測量SERS光譜的定量分析結果的標準方差也較小。MEMSERS的RMSEP和ARPE值分別為0.05 μmol/L和5.1%，均明顯小于PLSR模型的相應值。另外，通過估算得到MEMSERS對血漿體系中甲巰咪唑的檢出限為32 nmol/L，優于文獻中采用的氣相色譜-質譜法的檢出限（45 nmol/L）【5， 6】。endprint

為了驗證MEMSERS模型預測結果的可靠性，采用另一份正常人的血漿（新血漿），按照上述血漿預測樣本的配制方法重新配制一組血漿預測樣本，并使用建立的MEMSERS模型對這一組血漿預測樣本中的甲巰咪唑濃度進行定量分析。結果表明，MEMSERS模型的預測結果的準確度很高，其RMSEP和ARPE值分別為0.06 μmol/L和5.4%，與前面所獲得結果幾乎完全一致。因此，待測樣本基質的變化也不影響MEMSERS對血漿預測集樣本中甲巰咪唑的定量分析結果。

3.3.2 藥片中甲巰咪唑的定量分析 SERS技術結合MEMSERS模型和LC-MS/MS對一片藥片中甲巰咪唑含量的測定值分別為5.4和5.0 mg。這兩種方法的檢測結果基本一致，并且十分接近該藥片所附說明書上標注的規格（5 mg/片）。表3列出了MEMSERS和 LC-MS/MS對藥片預測集樣本中甲巰咪唑的定量分析結果。從表3可知，MEMSERS定量分析結果的平均加標回收率在93.3%～110.9%之間，與LC-MS/MS定量分析結果的準確度基本一致，表明SERS技術結合MEMSERS模型方法能準確測定復雜體系中甲巰咪唑的含量，并且有望發展成為復雜體系中甲巰咪唑含量的常規定量分析方法。表3 MEMSERS和 LC-MS/MS對藥片預測樣本中甲巰咪唑的定量分析結果

4 結 論

采用了MEMSERS模型消除SERS增強基底物理性質的不均一性對SERS定量分析結果的不利影響，以實現血漿和藥片樣本中甲巰咪唑的準確定量檢測。結果表明，建立在超純水配制的甲巰咪唑校正集樣本SERS光譜數據上的MEMSERS模型能夠從血漿預測集樣本和藥片預測集樣本的SERS光譜中準確預測出相應甲巰咪唑的含量。MEMSERS對血漿預測集樣本中甲巰咪唑含量的平均相對預測誤差約為5.1%，檢出限達到了32 nmol/L，而且待測樣本的基質變化不影響MEMSERS定量分析結果的準確度；MEMSERS模型對藥片預測集樣本中甲巰咪唑含量的預測結果的回收率在93.3%～110.9%之間，與LC-MS/MS對照實驗的結果基本一致。SERS技術與MEMSERS模型相結合檢測甲巰咪唑的方法具有簡便、快捷、靈敏度高、檢出限低的特點，有望發展成為復雜體系中甲巰咪唑含量的常規定量分析方法。

References

1 Weetman A P， McGregor A M， Hall R. Clin. Endocrinol.， 1984， 21（2）： 163-172

2 Kendall-Taylor P. Br. Med. J. 1984， 288（6416）： 509

3 Hollosi L， Kettrup A， Schramm K W. J. Pharm. Biom. Anal.， 2004， 36（4）： 921-924

4 Kusmierek K， Bald E. Talanta， 2007， 71（5）： 2121-2125

5 Zou Q H， Liu Y， Xie M X， Han J， Zhang L. Anal. Chim. Acta， 2005， 551（1）： 184-191

6 Zhang L， Liu Y， Xie M X， Qiu Y M. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（1）： 1-7

7 Shahrokhian S， Ghalkhani M. Electroanalysis， 2008， 20（10）： 1061-1066

8 Sun J Y， Zhang C Y， Xiao X L， Niu L， You T Y， Wang E K. Electroanalysis， 2005， 17（18）： 1675-1680

9 Economou A， Tzanavaras P D， Notou M， Themelis D G. Anal. Chim. Acta， 2004， 505（1）： 129-133

10 Kneipp K， Wang Y， Kneipp H， Perelman L T， Itzkan I， Dasari R R， Feld M S. Phys. Rev. Lett.， 1997， 78（9）： 1667

11 Nie S， Emory S R. Science， 1997， 275（5303）： 1102-1106

12 LIANG Man-Fen， ZHOU Dian-Ming， WANG Yu， CHEN Cui-Hua， JIANG Jian-Hui. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（9）： 1341-1347

梁滿芬， 周殿明， 王 玉， 陳翠花， 蔣健暉. 分析化學， 2013， 41（9）： 1341-1347

13 Otto A， Mrozek I， Grabhorn H， Akemann W. J. Phys.： Condens. Matter， 1992， 4（5）： 1143

14 NI Dan-Dan， WANG Wei-Wei， YAO Jian-Lin， ZHANG Xie-Jiao， GU Ren-Ao. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2011， 31（2）： 394-397

倪丹丹， 王偉偉， 姚建林， 張雪嬌， 顧仁敖. 光譜學與光譜分析， 2011， 31（2）： 394-397

15 FAN Xiao-Min， ZOU Wen-Jun， GU Ren-Ao， YAO Jina-Lin. Chem. J. Chinese Universities， 2008， 29（1）： 130-134

范曉敏， 鄒文君， 顧仁敖， 姚建林. 高等學校化學學報， 2008， 29（1）： 130-134

16 Xia T H， Chen Z P， Chen Y， Tin J W， Yu R Q. Anal. Methods， 2014， 6（7）： 2363-2370

17 Song J， Chen Z P， Jin J W， Chen Y， Yu R Q. Chemom. Intell. Lab. Syst.， 2014， 135： 31-36

18 Lee P C， Meisel D. J. Phys. Chem.， 1982， 86（17）： 3391-3395

19 Tin J W， Chen Z P， Li L M， Steponavicius R， Thennadil S N， Yang J， Yu R Q. Anal. Chem.， 2011， 84（1）： 320-326endprint