綠原酸磷脂復合物固體分散體的體外溶出和藥動學研究

趙安權　王倩倩　李佳　樊萌春　賀英菊

摘要：為研究綠原酸磷脂復合物固體分散體（CA-PC-SD）的體外溶出以及體內藥動學規律，采用HPLC法考察CA-PC-SD的體外溶出，大鼠灌胃后測定其血藥濃度，并采用DAS 2.0軟件分析計算藥動學參數。結果顯示：CA-PC-SD顯著改善綠原酸磷脂復合物（CA-PC）的溶出效果，相較于原料藥（CA）其相對生物利用度提高2.12倍。表明CA-PC-SD能顯著改善CA-PC的體外溶出特性以及cA的口服生物利用率。

關鍵詞：綠原酸；磷脂復合物；固體分散體；溶出度；藥動學；口服生物利用度

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2015）01-0054-04

0引言

綠原酸（chlorogenic acid，cA），是一種苯丙素類化合物，由咖啡酸（caffeic acid）和奎尼酸（quinic acid）縮合而成，又名咖啡鞣酸，在金銀花、野菊花、杜仲、蒲公英、向日葵等多種植物中均有發現。綠原酸生物活性十分廣泛，具有利膽、抗菌、抗病毒、穩定血糖、增加白血球、止血、縮短血凝和出血時間以及增強免疫等多種藥用功能；但由于其脂溶性差、體內消除半衰期短、代謝廣泛、口服生物利用度低，從而限制了臨床的應用。研究表明，磷脂復合物能有效提高藥物的脂溶性，但由于磷脂復合物的溶出效果不佳，極大影響了口服生物利用度。本文將綠原酸磷脂復合物進一步制成綠原酸磷脂復合物固體分散體，旨在改善磷脂復合物的溶出效果，并與原料藥cA和磷脂復合物（CA-PC）相比較，研究了大鼠體內的藥動學過程及生物利用度，為綠原酸口服新劑型的研制提供了實驗依據。

1材料

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）；CPA225D型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；RE-52CS旋轉蒸發儀（上海雅榮生化設備有限公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（常州普天儀器制造有限公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；ZP-200振蕩器（江蘇太倉市實驗設備廠）；DW-F L270低溫冰箱（中科美菱）。綠原酸原料（自制）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201314，純度96.6%）；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-200912，純度96%）；大豆卵磷脂（德國Lipoid）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30，成都市科龍化工試劑廠）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。雄性SD大鼠（四川大學華西實驗動物中心），體重（210±20）g。

2方法與結果

2.1樣品的制備

由于課題組在前一階段已經完成對綠原酸磷脂復合物（CA-PC）的最佳工藝研究，即在20℃下，以無水乙醇為反應溶劑，綠原酸與磷脂最佳質量比為1：1，反應體系中綠原酸質量濃度為7.5 mg/mL，磁力攪拌2 h。反應完成后在體系中繼續加入一定量的PVP-K30，超聲5min使其溶解，轉至旋轉蒸發儀中，60℃除去無水乙醇即得綠原酸磷脂復合物固體分散體（CA-PC-SD），粉碎，過篩，裝膠囊備用。

2.2 CA-PC-SD中CA的體外含量測定方法

1）色譜條件。采用Aichcrombood AQ C18色譜柱（250 minx4.6 minx5 μm），以乙腈-0.1%磷酸（20：80）為流動相，檢測波長323 nm，柱溫40℃，流速1mL/min，進樣量20μL，測得結果如圖1所示，制劑中輔料不會干擾CA的測定，此色譜條件下CA與雜質分離良好。

2）線性范圍的考察。取適量的綠原酸對照品，精密稱定，用甲醇溶解并配制儲備液。精密吸取適量儲備液，配制質量濃度分別為3.90，7.80，9.75，15.60，19.50，23.40，31.20，39.00，58.50μg/mL的對照品溶液，進樣并記錄峰面積。以樣品濃度對峰面積進行線性回歸，回歸方程為Y=717987X-54210（r=-0.9995），線性范圍為3.90～58.50μg/mL。

2.3 CA-PC-SD中CA體內分析方法的建立

1）血漿樣品的處理。大鼠尾靜脈采集血樣0.3 mL，置于預先肝素化的0.5mL離心管中，振搖，8000r/min離心5 min，取上層血漿100μL于另一0.5 mL離心管中，加入內標（含葛根素100μg/L）的甲醇溶液100μL以及100μL甲醇-0.2%磷酸溶液（20：80），渦旋振蕩2min，8000r/min離心5min，取上清液20μL進樣。

2）色譜條件與專屬性考察。采用Aichcrombood-AQ C18色譜柱（250 mmx4.6 mmx5 μm），以乙腈-0.2%甲酸（15：85）為流動相，檢測波長323 nm，柱溫40℃，流速1 mL/min，進樣量20μL。在此色譜條件下，測得空白血漿、空白血漿加CA對照品和內標葛根素、大鼠血漿樣品加內標葛根素的色譜圖（見圖2）。由圖可見，CA的峰形良好，內源性物質不干擾CA與內標的分離測定。

3）血漿標準曲線。取適量的綠原酸對照品，精密稱定，用甲醇溶解并配制成儲備液。精密吸取儲備液適量，用甲醇溶液稀釋，得質量濃度分別為25.88，51.75，103.50，207.10，414.10，828.13，1 656.25 ng/mL的標準CA溶液各100μl，加入空白血漿100μl，混勻，配成含CA的標準血漿樣品，按2.3.1血漿樣品處理步驟和2.3.1方法進樣，記錄峰面積。以CA與內標峰面積之比（y）對血漿中CA的質量濃度（x）進行線性回歸，回歸方程為Y=0.0002X+0.009 1（r²=0.9993），線性范圍為25.88～1 656.25 ng/mL。

4）精密度試驗。取15支0.5 mL離心管，均分為3組，加入空白血漿100μL，加入質量濃度分別為25.88，207.10，1656.25 ng/mL CA對照品溶液100μL，混勻，配成含CA的標準血漿樣品，于1d內連續測定5次及連續測定3d，計算日內、日間精密度。其日內精密度RSD分別為4.85%、3.93%、2.73%，日間精密度RSD分別為5.04%、4.83%、3.95%，結果說明此方法的精密度良好，符合生物樣品的測定要求。

5）回收率實驗。取15支0.5mL離心管，均分為3組，加入空白血漿100μL，分別加入低、中、高3種不同質量濃度的綠原酸對照品溶液100μL，混勻，配成含CA的標準血漿樣品，按照所建立的方法進行處理及測定，測得低、中、高質量濃度分別為25.88，207.10，1656.25ng/mL的含CA樣品的回收率分別為100.8%、99.7%、101.4%。

6）樣品穩定性考察。取空白血漿100μL，制備質量濃度分別為25.88，207.10，1 656.25 ng/mL的含藥血漿樣品（n=5），按2.3.1方法處理后，室溫放置0，10，24 h后再測定，記錄樣品峰面積，計算實測質量濃度，并與0時刻測定結果進行比較。結果表明低、中、高3種質量濃度的樣品放置0，10，24 h后，RSD均≤5.0%。

2.4體外溶出試驗

取CA-PC及含不同量PVP-K30的固體分散體（CA-PC-SD），碾碎，研磨裝膠囊，采用中國藥典規定的小杯法，于200mL水中，溫度（37±0.5）℃，轉速100 r/min，CA-PC分別于10，30，60，90，120，180min，而CA-PC-SD分別于5，10，20，30，45，60，90min取樣5mL，并同時補充同溫等量新鮮介質，過0.45μm微孔濾膜，取續濾液1mL稀釋后，照含量測定2.2.1方法進樣檢測，測定綠原酸質量濃度，計算累積釋藥百分率，結果見圖3。

從圖中不難看出CA與PVP-K30以1：3、1：5、1：7的比例形成CA-PC-SD時均能夠顯著提高溶出效果，相較于CA-PC，在溶出速率和溶出百分比上優勢明顯，而從最終產物的聚集狀態、反應時間和成本等因素考慮，優選1：5時為最佳處方進行生物利用度的考察。

2.5大鼠體內生物利用度實驗

將15只SD雄鼠隨機分成3組，正常飼養一周，實驗前禁食12h，只給飲水，分別灌胃給予200mg/kg的原料藥CA和相應劑量的CA-PC以及CA與PVPK30之比為1：5的CA-PC-SD。原料藥CA組分別于3，10，17，25，35，60，90，180，240，300，360，480 min斷尾靜脈取血，其余組分別于8，15，30，45，60，90，120，150，240，360，480，500min斷尾靜脈取血，然后迅速裝入肝素化的0.5mL離心管中，振搖，8000r/min離心5min，分離血漿，于-40℃冰箱儲存。取血漿100μL按2.3.1方法處理后，按2.3.2下條件進樣測定，根據則定結果繪制CA的平均血藥濃度一時間曲線，如圖4所示。

采用藥動學DAS 2.0軟件分析計算主要藥動學參數，根據二室模型依賴性參數估算方法，求得兩者的藥動學主要參數，結果見表1。

由表中的主要藥動學參數可以看出：CA-PC-SD較原料藥CA和CA-PC而言，AUC_0-t、AUC_0-∞均明顯增大，表明前者的吸收比后二者顯著改善。CA-PC-SD的平均達峰時間T_max以及MRT_0-t也較原料藥CA延長，可見其在體內的吸收時間延長，平均滯留時間增加。從C_max可以看出，CA制成磷脂復合物固體分散體后，F=（AUC_CA-PC-SDAUC_CA）×100%=（3 095.0/1 548.4）×100%=212.2%，結果表明CA制成磷脂復合物固體分散體后，口服生物利用度提高2.12倍。

3討論

CA屬于生物藥劑學中第3類藥物，水溶性好，脂溶性差，因此口服生物利用率低。實驗從改善其口服生物利用率入手，旨在以磷脂復合物這一劑型為載體改善其脂溶性，從而間接提高跨膜能力，促進口服吸收。但課題組前一階段的研究中發現，雖然磷脂復合物確實積極的改觀了CA的脂溶性，但是由于CA-PC的溶出效果太差，直接影響了生物利用度的提高。所以，作者將磷脂復合物進一步開發為固體分散體，從實驗數據可以看出，固體分散體的溶出速率和累積溶出百分比都大大優于磷脂復合物組，這對固體制劑口服生物利用度的影響必然是有益的。實驗中選擇CA與PVP K30的比例為1：5的固體分散體與原料藥CA和CA-PC相比較，進行大鼠藥動學的試驗，得到了更為確切的結論：CA-PC-SD的AUC。AUC_0-∞、C_max均遠高于CA和CA-PC組，這也充分說明溶出效果的改良能促進口服生物利用度的提高，表現出了良好的體內外相關性。

從大鼠藥動學的結果分析CA-PC組的吸收效果提高并不明顯，但表現出了一定的緩釋能力，這可能與其釋藥行為有關。

4結束語

本實驗將CA制備成CA-PC-SD，有效改善了其口服吸收，并建立了CA的體內外檢測方法，為其體內外檢測提供了理論依據，對CA的體外溶出的研究和體內生物利用度的考察，為CA口服新劑型的研制提供了參考。