苦參堿聯合卡鉑對人胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響

汪順才 毛 玲 梁 靚 左 念 祝 寅江蘇省句容市人民醫院血液腫瘤科，江蘇句容 212400

苦參堿聯合卡鉑對人胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響

汪順才 毛 玲 梁 靚 左 念 祝 寅
江蘇省句容市人民醫院血液腫瘤科，江蘇句容 212400

[摘要]目的 探討苦參堿聯合卡鉑對人胃癌SGC-7901細胞抑制增殖及誘導凋亡的機制。 方法 將體外培養人SGC-7901細胞分為對照組、苦參堿組（1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL）、卡鉑組（0.01mg/mL）及苦參堿聯合卡鉑組。MTT檢測各組細胞增殖抑制率，FCM檢測各組細胞凋亡率，RT-PCR檢測各組細胞的CXCR4 mRNA表達。 結果 相同濃度苦參堿聯合卡鉑組增殖抑制率及凋亡率明顯高于單藥苦參堿組（P＜0.05）及其單藥卡鉑組（P＜0.05）。與對照組比較，各實驗組CXCR4mRNA灰度值均降低（P＜0.05）。相同濃度苦參堿聯合卡鉑組灰度值明顯低于單藥苦參堿組（P＜0.05）及其單藥卡鉑組（P＜0.05）。 結論 苦參堿聯合卡鉑能發揮正協同作用人胃癌SGC-7901細胞，劑量依賴性的抑制其增殖并誘導凋亡，該作用可能與抑制細胞內CXCR4 mRNA 表達有關。

[關鍵詞]人胃癌SGC-7901細胞；苦參堿；卡鉑；趨化因子受體4

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，早期患者大多無明顯臨床癥狀，通常發現時，都處于晚期[1]。化療是目前治療胃癌的主要手段。卡鉑（carboplatin）為第二代鉑類化療藥物，屬于細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，廣泛用于包括胃癌在內的實體瘤的治療。然而，臨床在追求療效的同時，毒副作用也很明顯[2]。中藥苦參堿抗腫瘤作用近年受到學者廣泛關注[3-6]，本實驗采用不同濃度苦參堿聯合卡鉑作用于人胃癌SGC-7901細胞，觀察苦參堿與卡鉑是否有協同抗人胃癌SGC-7901細胞的作用及其作用機制。

1 實驗材料

人胃癌SGC-7901細胞株購自中國科學院細胞庫；苦參堿（粉末，純度≥98%）購自中鑫科技生物有限公司；卡鉑注射液（規格10Ml:100mg，齊魯制藥有限公司，H20020180）購自句容市人民醫院；四甲基偶氮唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽公司；CXCR4mRNA、β-actin由艾博思生物工程技術服務有限公司設計及合成；自動酶聯檢測儀；流式細胞儀；電泳儀等。

2 方法

2.1細胞培養

SGC-7901細胞(細胞代數：P2）在RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素）中培養傳代，5～7d傳代1次。孵育箱培養條件：37℃，5%CO2，100%濕度。保持細胞處于指數生長期。

2.2分組

（1）（陰性）對照組：僅人SGC-7901細胞不經任何處理。（2）苦參堿1.0mg/mL組；（3）苦參堿2.0mg/mL組；（4）苦參堿3.0mg/mL組；（5）卡鉑0.01mg/mL組；（6）苦參堿1.0mg/mL聯合卡鉑組；（7）苦參堿2.0mg/mL聯合卡鉑組；（8）苦參堿3.0mg/mL聯合卡鉑組。

2.3SGC-7901細胞增殖抑制率檢測

將對數生長期1×104/mL的SGC-7901細胞，接種于96孔培養板中，按實驗分組加藥，作用24h。各組同時進行MTT分析，設陰性對照組，每組6個復孔，每孔加MTT（5mg/mL）20μL，孵育4h后吸去孔內上清液，每孔加150μL DMSO，震蕩15min，1h內酶標儀測定各孔492 nm波長的吸光度( OD 值)。增殖抑制率=（1-實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。

2.4SGC-7901細胞凋亡率檢測

取對數生長期細胞，以1×105個/孔接種于六孔板中，按上述實驗分組加藥，作用24h。各組同時進行FCM檢測。4℃預冷的PBS洗滌2次，1000rpm/min離心10min(離心半徑 15cm)，重懸于200μL Binding Buffer中；加入10μL Annexin V-FITC后，室溫避光15min，再加300μL Binding Buffer 及5μL PI 充分混勻，于1h內上流式細胞儀檢測凋亡率。

2.5SGC-7901細胞CXCR4 mRNA表達檢測

將細胞制成1×104/mL細胞懸液接種于50mL細胞培養瓶中。每組設3個樣本。提取總RNA(Trizol Reagent法)，紫外分光光度計檢測RNA純度及完整性，以OD260/OD280在1.8～2.0之間為純凈RNA的標準。按說明書步驟逆轉錄mRNA為cDNA。PCR擴增：（1）CXCR4引物：產物大小為127bp。上游序列5’-CTGCCCTCCTGCTGACTATTCC-3’；下游序列5’-ATGATGTGCTGAAACTGGAACAC-3’。β-actin引物：產物大小為130bp。上游序列5’-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3’；下游序列為5’-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3’。（2）引物及內參照擴增：反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，56℃(CXCR4) /56℃(β-actin)退火30s，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。利用電腦成像分析系統檢測PCR產物與β-actin的積分光密度比值，半定量分析目的基因的表達。

2.6統計學分析

3 結果

3.1MTT檢測苦參堿聯合卡鉑對SGC-7901細胞增殖抑制率的影響

隨著單藥苦參堿濃度（1.0～3.0mg/mL）的增高，抑制率逐漸增高（F=120.88，P＜0.05）。苦參堿（1.0～3.0mg/mL）聯合卡鉑組（0.01mg/mL）抑制率明顯高于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性（P＜0.05）。表明苦參堿聯合卡鉑能發揮正協同作用抑制細胞增殖。見表1。

表1　各組細胞增殖抑制率及凋亡率（±s，%）

表1　各組細胞增殖抑制率及凋亡率（±s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與苦參堿1.0mg/mL組比較，bP＜0.05；與苦參堿2.0mg/mL組比較，cP＜0.05；d與苦參堿3.0mg/mL組比較，dP＜0.05；與卡鉑組比較，eP＜0.05；與苦參堿1.0mg/mL+卡鉑組比較，fP＜0.05g；與苦參堿2.0mg/mL+卡鉑組比較，gP＜0.05。

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3.2 FCM檢測苦參堿聯合卡鉑對SGC-7901細胞凋亡率的影響

各單藥苦參堿組(1.0～3.0mg/mL)凋亡率均高于對照組，且隨著苦參堿濃度的增高，凋亡率逐漸增高（F=52.05，P＜0.05）。苦參堿(1.0～3.0mg/mL)聯合卡鉑組（0.01mg/mL）凋亡率明顯高于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性（P＜0.05）。表明苦參堿聯合卡鉑能發揮正協同作用誘導細胞凋亡。見表1。

3.3RT-PCR檢測CXCR4 mRNA的表達

本實驗對照組中灰度值比值為（0.86±0.03）高于（1.0～3.0mg/mL）苦參堿單藥組（P＜0.01）。隨苦參堿藥物濃度增加，灰度值比值逐漸降低（分別為0.71±0.02、0.63±0.01、0.56±0.03，F=108.44，P＜0.01）。苦參堿（1.0～3.0mg/mL）聯合卡鉑組（0.01mg/mL）灰度值比值分別為（0.52±0.02、0.45±0.03、0.26±0.03）明顯低于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組（0.61±0.07），具有濃度依賴性（P＜0.05）。表明苦參堿聯合卡鉑能發揮正協同作用抑制細胞增殖及誘導凋亡可通過降低CXCR4 mRNA 表達實現。見圖1。

圖1　細胞表達電泳圖M：Marker；A：對照組 B：苦參堿1.0mg/mL組 C：苦參堿2.0mg/mL組 D：苦參堿3.0mg/mL組 E：卡鉑 0.01mg/mL 組 F：苦參堿1.0mg/mL 聯合卡鉑組 G：苦參堿2.0mg/mL聯合卡鉑組 H：苦參堿3.0mg/mL 聯合卡鉑組

4 討論

苦參堿（matrine）是從豆科植物中提取的活性成分。研究表明，苦參堿在抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、抗病毒、保肝、抗過敏、抗心律失常等方面具有廣泛的藥理活性[7-11]。化療雖是胃癌的主要治療手段，相比單藥化療，聯合中藥方案能有效減輕傳統化療藥物的副作用，并能提高療效。研究發現，苦參堿聯合順鉑能抑制神經母細胞瘤細胞增殖并誘導其凋亡，且能提高順鉑化療的敏感性[12]。苦參堿聯合阿霉素呈時間及劑量依賴性抑制乳腺癌細胞增殖及誘導凋亡，且證實苦參堿可作為抗癌藥的化療增敏劑[13]。目前苦參堿聯合卡鉑是否能發揮正協同作用人胃癌SGC-7901細胞，尚未有文獻報道。

本實驗通過MTT及FCM檢測，發現苦參堿在1.0～3.0mg/mL濃度范圍內能抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖并誘導其凋亡，呈劑量依賴性。隨著苦參堿濃度的增高，抑制率及凋亡率逐漸增高。臨床上，卡鉑單藥應用對人體造成相當大的毒副作用，如消化道反應：惡心、嘔吐；骨髓抑制：中性粒細胞、血紅蛋白及血小板計數下降；耳毒性：腎、膀胱、輸尿管毒性：急性腎功能衰竭。從臨床長期應用看，單藥化療效果不甚理想。本實驗通過不同濃度（1.0～3.0mg/mL）苦參堿聯合卡鉑（0.01mg/mL）作用人胃癌SGC-7901細胞，發現聯合組的抑制率及凋亡率明顯高于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性。表明苦參堿聯合卡鉑能發揮正協同作用抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖及誘導其凋亡。

胃癌的發病機制復雜，其發生及發展關系到癌基因的激活及抑癌基因的失活等。因此，檢測胃癌相關基因的表達有助于胃癌的診斷、治療及預后[14]。趨化因子（chemokines)通過作用于趨化因子受體參與白細胞浸潤至腫瘤，刺激腫瘤細胞增殖及調節腫瘤相關血管生成。趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4) 為含有7個跨膜區的G蛋白耦聯受體的超家族，由352個氨基酸組成[15-16]，在腫瘤細胞（如胃癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、結腸癌、甲狀腺癌）中普遍表達，且在腫瘤的增殖、侵襲、浸潤、播散、轉移及免疫抑制等方面發揮重要作用[17-18]。研究發現CXCR4在胃癌組織中高表達，且在有淋巴結轉移的胃癌組織表達更顯著，可作為判斷胃癌患者病程及預后的重要指標[19]。在胃癌的發生發展中，下調CXCR4mRNA表達可能成為治療胃癌的新的靶點。

通過RT-PCR檢測CXCR4mRNA表達，發現一定濃度范圍內（1.0～3.0mg/mL）苦參堿組CXCR4mRNA表達低于對照組，具有劑量依賴性。苦參堿（1.0～3.0mg/mL）聯合卡鉑組（0.01mg/mL）CXCR4 mRNA表達明顯低于單藥苦參堿組及單藥卡鉑組，具有濃度依賴性。表明苦參堿聯合卡鉑能發揮正協同作用抑制細胞增殖及誘導凋亡可通過降低CXCR4 mRNA 表達實現。

綜上，本實驗條件下，一定濃度范圍內苦參堿聯合卡鉑能發揮正協同作用人胃癌SGC-7901細胞，劑量依賴性的抑制其增殖并誘導凋亡，該作用可能與下調細胞內CXCR4 mRNA 表達有關。為目前尚無有效藥物治愈胃癌提供實驗依據。

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[中圖分類號]R329.26

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2015）23-35-04

[基金項目]江蘇大學醫學臨床科技發展基金項目（JLY20140074）

收稿日期：（2015-10-05）

Effects of matrine and carboplatin of proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 cells

WANG Shuncai MAO Ling LIANG Liang ZUO Nian ZHU Yin
Department of Hematology Oncology,Jurong People's Hospital,Jurong 212400,China

[Abstract]Objective To investigate the effects of matrine and carboplatin on the CXCR4 expression of proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 in vitro,and its potential mechanism. Methods SGC-7901 cells were treated with matrine(final concentrations=1.0,2.0 and 3.0mg/mL) and carboplatin(final concentrations=0.01mg/ mL),either each alone or in combination.The viability in treated SGC-7901 cells was assessed by MTT.Cell apoptosis of SGC-7901 was assessed by flow cytometry.CXCR4 mRNA abundance by RT-PCR. Results Matrine and carboplatin,either each alone or in combination,significantly increased inhibition rate (P＜0.05),significantly higher apoptotic rate(P＜0.05),and decreased CXCR4mRNA abundance(P＜0.05).The above effects of SGC-7901 cells were more pronounced when they were jointed in combination than they were used alone(P＜0.05). Conclusion Matrine and carboplatin in combination can signifcantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner,the observed effects of matrine may be related to decreased CXCR4 expression.

[Key words]SGC-7901;Matrine;Carboplatin;Chemokine receptor 4