壓力性尿失禁大鼠模型陰道前壁組織中結締組織生長因子和整合素β1的表達

崔燦　王志蓮　郝敏等

[摘要] 目的 探討結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）及整合素β1（integrin β1）在壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）大鼠模型陰道前壁中的表達。 方法 將健康雌性SD大鼠24只隨機分為3組，A組大鼠作為對照組不做任何處理；B組大鼠僅行陰道擴張；C組大鼠行陰道擴張加雙側卵巢切除。于術后第4周測定最大膀胱容量（MBC）和腹壓漏尿點壓（ALPP），檢測壓力性尿失禁模型是否建立成功。建模成功4周后處死大鼠后取陰道前壁組織，行免疫組化染色方法和實時熒光定量TR-PCR技術檢測CTGF和整合素β1的表達。結果 尿流動力學檢測（MBC、ALPP）：B、C組較A組明顯降低，且各組之間比較均有統計學意義（P<0.05）；CTGF mRNA與蛋白質的表達C組低于A組（P<0.05），A、B兩組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）；C組整合素β1 mRNA及蛋白質的表達明顯低于A、B組（P<0.05），且A、B兩組之間比較差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 在SUI大鼠陰道前壁CTGF和整合素β1的低表達可能與壓力性尿失禁等盆底支持結構的退行性病變的發生存在密切關系。

[關鍵詞] 壓力性尿失禁；結締組織生長因子；整合素β1

[中圖分類號] R694.54 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）11-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of the connective tissue growth factor（CTGF） and integrin β1 in vaginal anterior wall of the model rats with stress urinary incontinence. Methods Twenty-four healthy female SD rats were randomly divided into three groups， group A rats as control group without any treatment；group B rats only with vaginal expansion；group C rats with vaginal expansion and bilateral ovaries removed. At postoperative four weeks to determine the maximum bladder capacity （MBC） and abdominal pressure leakage point pressure （ALPP）， to establish detection model for stress urinary incontinence. Modeling successfully executed in rats after four weeks after vaginal anterior wall tissue， immunohistochemical staining method and real-time fluorescent quantitative RT-PCR technique to detect the expression of CTGF and integrin β1. Results The urine flow dynamic detection （MBC， ALPP）： B and C group was significantly lower than group A， there were statistically significant differences（P<0.05）；CTGF mRNA and protein expression in group C was significantly lower than group A （P<0.05）， there were no statistical significance between group A and group B（P>0.05）；integrin β1 mRNA and protein in group C expression was lower than that in group A and B（P<0.05）， and differences between A and B were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The anterior wall vaginal CTGF in rats in SUI and low expression of integrin β1 may be related to stress urinary incontinence and other pelvic floor support structure there is a close relationship of the occurrence of degenerative diseases of the pelvic floor support degenerative diseases.

[Key words] Stress urinary incontinence； Connectivetissue growth factor； Integrin β1

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI） 定義為在無逼尿肌收縮的情況下，腹壓增高引起膀胱內壓增高，超過尿道和括約肌產生的壓力，尿液自尿道外口漏出的現象[1]。威脅生命且嚴重影響到患者的心理、生理健康，同時會給社會造成一定程度的經濟負擔。盆底結締組織結構改變或功能減弱的分子學機制是目前壓力性尿失禁研究的熱點[2]。近些年來對于SUI發病機制的研究越來越受到重視，研究表明[3]，在SUI患者盆底支持結構中，膠原彈性蛋白含量的減少會導致支持組織彈性減弱，從而出現盆底的松弛，進一步導致SUI。而結締組織生長因子（connectivetissue growth factor，CTGF）可以刺激成纖維細胞增殖和分泌膠原，在纖維化性疾病創傷后瘢痕形成等方面有較多的研究，含β1亞單位的整合素主要介導細胞與細胞外基質成分之間的黏附，近年研究發現CTGF可以通過與整合素受體結合調節細胞內信號通路的活性。然而關于整合素β1在SUI發生發展機制的相關研究較為少見。本實驗的研究目的為檢測CTGF和整合素β1在壓力性尿失禁大鼠模型的陰道前壁中的表達，進一步探究其在壓力性尿失禁發生機制中的作用，以期為壓力性尿失禁的預防、治療提供實驗基礎及理論依據。

1材料與方法

1.1 實驗動物

24只健康雌性SD大鼠由山西醫科大學生理實驗室提供，體重220～250 g。隨機分三組，每組8只：A組不做任何處理；B組行陰道擴張模擬難產；C組模擬難產加雙側卵巢切除。4周后經檢測建模是否成功（尿動力學檢測和噴嚏實驗證實 ），見表1。

1.2 標本采集及處理

造模成功后常規喂養4周后將大鼠處死，取陰道前壁組織兩塊，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，反復、多次用生理鹽水洗凈，一塊放入加有中性緩沖液的10%的甲醛液中固定，準備行免疫組織化學檢測。另一塊立即放入-80℃液氮中，以避免mRNA降解，待行實時熒光定量TR-PCR技術檢測。

1.3 試劑

羊抗兔CTGF、整合素β1和β-actin多克隆抗體（博奧森生物技術有限公司），辣根過氧化酶的山羊抗鼠二抗（購于北京中杉金橋公司），試劑盒、RT-PCR盒及相關試劑（北京全式金生技術有限公司），引物（北京博大泰克生物技術公司）。

1.4 免疫組織化學檢測CTGF及整合素β1蛋白的表達

采用SABC法進行免疫組織細胞化學染色。結果判定：細胞外基質染為黃色或棕黃色為CTGF蛋白及β1整合素蛋白陽性。操作步驟按免疫細胞化學檢測試劑盒說明書進行。用BI 2000醫學圖像分析系統采集顯微鏡下圖像，隨機在每張免疫組化切片上選擇5個視野 （400倍），每個視野拍攝5張照片，根據陽性細胞個數（A）及細胞顯色程度（B）計算免疫組化評分（IHS），以其均值進行比較[4]。

1.5 實時熒光定量TR-PCR

按照Trizol試劑使用說明書提取總RNA，經AMV逆轉錄合成cDNA。引物堿基序列見表2。反應條件為：94℃預變性5 min，94℃預變性2 min，35個循環（94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min），72℃最后延伸5 min。根據實時熒光定量RT-PCR的原理，以β-actin基因mRNA的表達為內對照，首先計算出各目的基因的CT值與β-actin內參基因的CT值的差值，即ΔCT=CT（目的基因）-CT（β-actin），然后計算實驗組各樣本的ΔCT值與對照組樣本的ΔCT值的差值，從而得到ΔΔCT值，即ΔΔCT=ΔCT（實驗組）-CT（對照組），利用2-ΔΔCT進行計算，表示實驗組測定基因的表達相對于對照組樣本基因的表達的變化倍數[5]，將2-ΔΔCTx±s作為最后的定量結果用于統計分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間正態分布采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t法；不滿足正態性和方差齊性則采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 免疫組化檢測CTGF、整合素β1蛋白的表達

見圖1、2及表3。鏡下3組陰道前壁標本均可見CTGF蛋白及整合素β1蛋白表達于成纖維細胞胞漿。A組CTGF蛋白的等級資料免疫組化評分為（7.75±1.49）分，B組免疫組化評分為（6.25±1.91）分，C組免疫組化評分為（5.50±0.93）分，A組與B組比較差異無統計學意義（P>0.05），A組明顯高于C組，差異有統計學意義（P<0.05），B組與C組比較差異無統計學意義（P>0.05）；A、B、C三組整合素β1蛋白的免疫組化評分分別為（6.13±1.36）分、（5.00±1.07）分、（3.63±0.74）分，A組與B組比較差異無統計學意義（P>0.05），C組明顯低于A、B兩組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 RT-PCR檢測CTGF mRNA及整合素β1 mRNA的表達

見表4。B組、C組CTGF mRNA的表達量均低于A組，差異有統計學意義（P<0.05），但B組與C組比較差異無統計學意義（P>0.05）；C組整合素β1 mRNA的相對表達量低于A組、B組，差異有統計學意義（P<0.05），但B組與A組比較差異無統計學意義（P>0.05）。

3討論

壓力性尿失禁有“社交癌”之稱，嚴重地影響了女性的社交活動，同時還可引發心理障礙，給家庭和國家醫療服務增加一定的經濟負擔[5]。由于分娩、手術等原因所造成得盆底組織損傷與女性SUI有直接的關系。

隨后Batmunkh等[6]在PDGF誘導下的人類臍靜脈內皮細胞培養基中發現CTGF的分泌，并將其首次克隆出來。CTGF也稱作CCN2，屬于即刻早期基因（CCN）家族的成員之一[7]，其編碼基因定位于6號染色體長臂（6q23.1）上，是一種由349個氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的分泌性多肽[8]，分子量為36～38 kD[9]。CTGF的來源細胞種類繁多，如胚胎細胞、腎間質細胞、腎小球系膜細胞、肝星狀細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞等。CTGF在人類心臟、胎盤、肺、肝臟及腎臟等多種組織器官中均有表達。在組織損傷修復、纖維化、潰瘍愈合及腫瘤發生等多種組織重建相關性疾病中，CTGF均起到重要作用[10，11]。Daniels等[12]研究證實在成纖維母細胞中，少量表達的CTGF可促進膠原的收縮，控制基質金屬蛋白酶MMPs的作用，據此推測CTGF在SUI的發生發展中可能與盆底組織損傷后修復有關。目前利用脂肪源性干細胞（ADSC）增殖和分化為成纖維細胞來治療SUI，是盆底疾病領域的一個研究熱點[13，14]。有研究表明，在體外培養的大鼠脂肪干細胞中發現CTGF刺激可以使各型膠原表達逐漸增加，并且隨著刺激時間的延長而逐漸上升[15]。本實驗結果顯示，在壓力性尿失禁大鼠模型陰道前壁組織中，陰道擴張加雙側卵巢切除組的CTGF蛋白和mRNA表達水平均明顯低于正常組，但陰道擴張組及陰道擴張加雙側卵巢切除組CTGF的蛋白和mRNA水平的比較無明顯差異，提示在CTGF表達降低，可能減少刺激成纖維細胞的增殖和膠原的分泌，從而影響盆底結締組織結構的穩定性及完整性，可能是導致SUI發生的重要原因。

整合素β1是一類近年來新發現的CTGF的細胞表面受體，CTGF可以直接與其細胞表面的整合素β1受體結合進而啟動下游細胞信號轉導途徑，發揮促進纖維化的作用。有研究報道，在肝纖維化發生發展中，整合素β1發揮了調節細胞增殖、黏附等功能。目前國內外主要在心、肝及皮膚瘢痕等組織中對整合素β1進行研究，其過度表達可以導致一些纖維化性或增生性的疾病發生，如肝硬化、肝纖維化等。但是目前在SUI方面的研究較少見。本實驗結果顯示，在壓力性尿失禁大鼠模型陰道前壁組織中，陰道擴張加雙側卵巢切除組的整合素β1蛋白和mRNA表達水平均明顯低于正常組及僅陰道擴張組，提示在SUI的發生機制中，整合素β1表達的降低可能影響其作為受體與CTGF結合，將信號傳遞至細胞內，進一步導致盆底結締組織損傷后的修復。

綜上所述，多種因素綜合作用下導致盆底結締組織中膠原含量的減少及其作用的發揮，最終可能造成SUI的發生。CTGF/整合素β1信號轉導通路與SUI的發生機制的相關性研究，目前還在動物組織學水平的實驗階段，根據現有實驗結論推測，有效地抑制該通路，可能會引起成纖維分泌膠原蛋白的減少，而導致SUI的發生。如果能以此通路的作用機制作為今后SUI發生的研究靶點，進一步研究二者下游啟動哪些信號通路來發揮作用，可能為SUI的預防、治療提供一定的理論依據。

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（收稿日期：2015-01-28）