香蕉NPR1E基因的克隆及表達分析

王卓等

摘 要 NPR1基因可參與調節植物對病原菌的廣譜抗性，在植物系統抗性中起著關鍵的調控作用。通過RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法從香蕉根系中獲得NPR1E基因，命名為MaNPR1E（GenBank登錄號分別為：KF582550）。MaNPR1E是香蕉NPR1基因編碼框全長cDNA，包含一個1 755 bp的最大開放閱讀框，編碼一個含584個氨基酸的蛋白質。經蛋白質序列同源比對發現，其含有完整的BTB/POZ結構域、錨蛋白重復ANK序列和NPR1-like-C結構域，屬于典型的NPR1蛋白。系統進化樹比對分析表明，MaNPR1E與海棗PdNPR3（XP_008808341.1）和油棕EgNPR3（XP_010914123.1）的親緣關系較近。組織特異性研究表明，該基因組成型表達于香蕉各組織。實時熒光定量PCR分析表明，接種枯萎病菌后MaNPR1E的表達在感病品種中被抑制，而在抗病品種中被激活；MaNPR1E的表達受乙烯利和水楊酸的誘導。上述結果表明，MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病過程中扮演重要的調控角色。

關鍵詞 香蕉 ；MaNPR1E ；基因克隆 ；表達分析

分類號 S668.1

Molecular Cloning and Expression of MaNPR1E Gene from Banana

（Musa acuminata L. AAA group， cv. Cavendish）

WANG Zhuo1） XU Biyu1） JIA Caihong1） LI Jianping1）

LIU Juhua1） ZHANG Jianbin1） MIAO Hongxia1） JIN Zhiqiang1，2）

（1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101；

2 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou， Hainan 570102）

Abstract NPR1（nonexpressor of PR gene 1），involved in regulating plant broad-spectrum resistance，plays important roles in plant system resistance. In this study， we report the molecular characteristics of NPR1E gene cloned from banana（Musa acuminate L. AAA group， cv. Cavendish）using a RACE-PCR-based strategy. MaNPR1E（accession number：KF582550） contained an open reading frame of 1 755 bp which encoded a polypeptide of 584 amino acids. Protein alignment showed that they contain the complete typical conserved BTB/POZ （BR-C， ttk and bab/Pox virus and Zinc finger）domain， ankyrin repeats and NPR1/NIM1 like defence protein C terminal，which belongs to a typical NPR1 protein. Phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of MaNPR1E also have high similarity to PdNPR3（XP_008808341.1） and EgNPR3（XP_010914123.1） from Phoenix dactylifera and Elaeis guineensis，respectively. Tissue-specific studies showed that the expression of MaNPR1E was constitutive expressed in various tissues of banana seedling. In resistant and susceptible varieties of banana after inoculation Foc TR4， the expression of MaNPR1E was decreased. While in resistant varieties the time point of MaNPR1E， compared to control， increased higher than that in susceptible varieties at time points， also the expression of MaNPR1E was induced by Ethephon and salicylic acid. These results suggest that MaNPR1E may play an important role in the regulation of Banana resistance to the infection of Foc TR4.

Keywords banana ； MaNPR1E ； gene clone ； expression analysis

病原菌與植物在協同進化中，植物形成一系列復雜的防御機制來避免病原菌的侵害，如系統獲得抗性（Systemic acquired resistance， SAR）和誘導系統抗性（inducted systemic resistance， ISR）。SAR是植物在遭受病原菌侵染后產生的防御反應，通過激活PR基因的表達來抵抗病毒、細菌和真菌的侵染[1]，水楊酸是植物建立SAR所必須的物質[2]。ISR的建立依賴于茉莉酸（jasmonic acid， JA）和乙烯（ethylene， ET）的介導[3-4]。NPR1（nonexpressor ofpathogenesis related genes 1）參與植物SAR和ISR的建立[1-2，5]。NPR1 基因編碼的蛋白通常在N-末端包含一個BTB/POZ（broad-complex， tramtrack， and bric-a-brac/poxvirus and zinc finger）結構域和一個錨蛋白重復結構域ANK （ankyinrepeat domain）， 這2 個結構域在與其它蛋白質互作時起著重要作用[6-7]。NPR1參與的生理過程為：在正常生長狀態下，NPR1蛋白通過二硫鍵形成寡聚體存在于細胞質中。當植物感染病原菌后， SA 的積累改變了細胞中的氧化還原勢， NPR1寡聚體解體后形成單體，進入細胞核內并與TGA-bZIP轉錄因子互作，進而調控一些啟動子中含有as-1/ocs 順式作用元件的PR 基因的表達[2，8-9]。至今，已從多種植物中克隆了NPR1 基因及其同源基因，并對部分基因的功能進行了不同程度的研究[6，10]。到目前為止，已經克隆到香蕉NPR1基因中的4個成員，包括MNPR1A、MNPR1B[11]，MdNPR1[12]，MuNPR1-1[13]。在香蕉A基因組中預測出了8個NPR1基因[14]，表明香蕉NPR1基因的克隆及功能分析還需進一步完善。

香蕉是熱帶、亞熱帶發展中國家重要的農作物之一，其果實富含蛋白質和碳水化合物，是一些熱帶地區人們食用的主要水果種類和國民收入的主要來源[15]。然而香蕉枯萎病嚴重威脅香蕉的正常生產[16]。NPR1在植物抗病中起著重要作用，是調控植物抗病反應的一個關鍵基因[2，11-12]，因此了解香蕉NPR1基因的功能將有助于揭示NPR1介導的抗病途徑與香蕉枯萎病的密切關系。在此之前，筆者利用RNA-seq方法獲得香蕉根系轉錄組[17]，基于轉錄組信息從香蕉根系中克隆了一個MaNPR1E基因，利用生物信息學網站分析該基因的結構特性，采用熒光定量技術分析該基因的表達模式，探討枯萎病菌脅迫下MaNPR1在香蕉根系中的表達調控，有助于進一步了解香蕉抗枯萎病的調控機理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試香蕉品種為‘巴西蕉（cv. Cavendish AAA）和‘農科1號（cv. Nongke No. 1）（購自中國熱帶農業科學院組培中心），為移栽大棚后約60 d的健康杯苗，其中‘巴西蕉為病菌的感病品種，‘農科1號為病菌的耐病品種。香蕉枯萎病菌4號生理小種（FusariumOxysporum f specialis （f. Sp） cubense Tropical Race 4， Foc TR4），由中國熱帶農業科院環植所張欣博士饋贈。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的培養和收集

將于-80℃中以25%甘油保存的香蕉枯萎病4號生理小種孢子懸浮液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）上，于28℃培養7 d，用無菌水將孢子洗下來，用2層Mirocloth膜過濾，濾液以4 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用50 mL無菌水重懸，再以4 000 r/min離心15 min，孢子用無菌水洗2次，然后調到合適的濃度。

1.2.2 香蕉接種Foc TR4及激素處理

將‘巴西蕉和‘農科1號分為2組，每組60顆幼苗。以蘸根接菌法接種Foc TR4，接種濃度為1×106個/mL，分別于接種后2、4、6 d取樣，以未接種的為對照（0 d）；分別以100 μmol/L 脫落酸（abscisic acid，ABA）、1%（V/V） 乙烯利（ethephon， ETH）、100 μmol/L 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）和100 μmol/L 水楊酸（salicylic acid， SA）處理‘巴西蕉幼苗，以去離子水處理為對照。上述每個處理重復3次。于液氮中速凍后， 置于-80℃冰箱備用。

1.2.3 MaNPR1E的克隆及分析

在香蕉根系轉錄組測序結果的基礎上，設計5'RACE引物，按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）說明書進行RACE反應；擴增獲得的DNA序列經過測序后在NCBI核酸數據庫BLASTn和蛋白數據庫BLASTx中進行同源核苷酸和蛋白序列檢索；應用DNAMAN、ProtParam和MEGA4等生物軟件分析獲得cDNA序列及其編碼蛋白質的結構特點，并將其與NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）、香蕉A基因組數據庫（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中已知的核酸和蛋白序列進行比較分析。

1.2.4 MaNPR1E在香蕉不同器官中的表達分析

選取生長8個月的香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實，按照Wan等[18]的方法提取RNA；每個樣品取4 μg總RNA，用Invitrogen SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈；以香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實的cDNA為模板，以MaActin片段為內參，采用RT-PCR方法對其進行組織特異性表達分析；將MaNPR1E在香蕉A基因組數據庫（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中進行比對，以確定該基因是否屬于香蕉A基因組。在序列5′端非保守區域設計MaNPR1E基因表達引物，引物序列為P1（5′-GTTCGCCTTGTTCGGTTG-3′）和P2（5′-ACTTCGGATTGGATGGAC-3′）。MaActin1引物為P1（5′-CGAGGCTCAATCAAA-GA-3′）和P2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）。

1.2.5 MaNPR1E基因的表達檢測

采用實時定量PCR檢測MaNPR1E基因的表達，試劑盒購自TaRaKa公司，染料為SYBR Green，在Mx 3005P熒光定量PCR儀（吉泰生物科技公司）上進行。分別以接種Foc TR4后不同時間點的經ABA、乙烯利、茉莉酸甲酯和水楊酸處理過的巴西蕉根系cDNA第一鏈為模板，以MaActin片段為內標，引物同“1.2.4”。熒光定量PCR的反應程序如下：95℃預變性3 min；95 ℃變性7 S，60℃退火15 S，72℃延伸20 s，共40個循環。

1.3 數據統計分析

每個實驗組均做3 次生物學重復，利用SAS軟件（SAS 9.0 for Windows）進行顯著性分析，“*”、“**”分別表示差異達到顯著（p<0.05）和極顯著（p<0.01）水平。結果用KyPlot軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 MaNPR1E克隆與序列分析

在香蕉根系轉錄組測序[17]的基礎上，成功克隆一個香蕉NPR1基因ORF，測序后經BLAST比對發現，該序列與其他植物NPR1基因序列具有較高的同源性，表明該序列是香蕉NPR1基因編碼框全長cDNA，命名為MaNPR1E，GenBank登錄號為：KF582550。MaNPR1E序列全長為2 082 bp，其中5′非翻譯區123 bp，3′非翻譯區204 bp，含有一個1 755 bp的ORF，編碼584個氨基酸殘基（圖1），可編碼預期分子量為64.88 ku和等電點為6.66的氨基酸序列。將MaNPR1E推導的氨基酸序列與香蕉A基因組[14]進行比對，找到與其高度同源的蛋白序列GSMUA_Achr5P02120，進一步分析表明，兩者在氨基酸水平有4個位點存在差異，分別是第261、295、430、524號位點，相似度為99.32%。利用DNAMAN軟件將MaNPR1E與之前報道的4個NPR1（MNPR1A、MNPR1B[11]，MdNPR1[12]，MuNPR1-1[13]）進行比較發現，其相似度僅為53.48%（結果未顯示）。在GenBank中對MaNPR1E蛋白質進行保守結構域搜索和同源性分析，結果表明，MaNPR1E蛋白屬于NPR1家族成員，其氨基酸序列包含1個BTB/POZ結構域（73～198，圖2 紅線區域）、1個錨蛋白重復ANK序列（279～374，圖2藍線區域）和1個NPR1-like-C結構域（379～566，圖2 綠線區域）。利用軟件MEGA4.0中的NJ法構建MaNPR1E基因的氨基酸序列和其他植物的NPR類基因氨基酸序列的系統進化樹，結果發現，以MaNPR1E與海棗 （Phoenix dactylifera， XP_008806697.1）和油棕（Elaeis guineensis， XP_010908601.1）的NPR3蛋白同源關系最近（圖3）。

2.2 MaNPR1E組織特異性表達分析

采用熒光定量RT-PCR方法，以MaActin作為內參，分別檢測香蕉不同部位MaNPR1E mRNA轉錄水平的變化。結果表明，MaNPR1E在所有組織中均有表達；在假莖中表達量最高，是根中的1.8倍，在花中表達最低，約為根的一半（圖4）。

2.3 不同抗性的香蕉品種接種Foc TR4后MaNPR1E的表達分析

在感病品種中，MaNPR1E的相對表達量在接種FocTR4后逐漸下降，且差異達到極顯著水平。在接種后6 d時達到最低，僅為對照的1/3（圖5）。在耐病品種中MaNPR1E的相對表達量在接種Foc TR4后顯著增加，在接種后4 d時達到最大，是對照的4.1倍。因此從相對表達量的變化上看，MaNPR1E的表達在感病品種中被抑制，而在抗病品種中被激活，表明該基因參與香蕉抗枯萎病的過程。

2.4 MaNPR1E對激素處理的響應

為了檢測MaNPR1E對不同激素處理的響應情況，分別用脫落酸（ABA）、乙烯利（ethephon）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）對巴西蕉根系進行處理。MaNPR1E的表達受乙烯利和水楊酸的誘導，均在處理12 h達到最大值，其相對表達量分別為對照的3.97倍和2.07倍；MaNPR1E的表達在MeJA處理6、12 h時均被抑制，在24 h時恢復到對照水平；MaNPR1E的表達在ABA處理下顯著被抑制，在處理24 h時約為對照的1/3（圖6）。這些結果表明，MaNPR1E可能參與乙烯利和水楊酸介導的抗病信號途徑。

3 討論

NPR1是調控植物抗病的關鍵調節因子，通過調控病程相關基因的表達來提高植物對病原菌的抗病性。本研究獲得一個全長香蕉NPR1E基因（圖1）。在序列分析方面，該基因與其他植物的NPR1基因具有較高的同源性。MaNPR1E編碼的氨基酸分子量為64.88 ku，等電點為6.66，這與已報道的其它植物NPR1蛋白特征相似[6，8-9，11-13，19]。MaNPR1E推導的氨基酸序列中包含完整的BTB/POZ結構域、錨蛋白重復ANK序列和NPR1-like-C結構域（圖2），這些NPR1基因典型的特點表明MaNPR1E屬于植物NPR1基因[11-13]。將MaNPR1E在香蕉A基因組[14]數據庫中進行BLAST比對，結果發現一個與其高度同源的NPR1基因（表1），表明栽培的巴西蕉品種（AAA group）與測序的DH-Pahang品種（AA group）親緣關系很近，同時也表明，2個品種的NPR1基因是同源基因[14]，其差異主要是序列間的SNP形成的（結果未列出），這些SNP可以作為潛在的分子標記為后續的香蕉育種服務。聚類分析結果表明，MaNPR1E與海棗和油棕的NPR3親緣關系較近（圖3）。上述結果均表明，MaNPR1E基因編碼的蛋白確實為一個新的香蕉NPR1蛋白。

己有研究表明，NPR1基因在植物組織中呈組成型表達[20]，在本研究中，供試的根、球莖、假莖、葉、花和果實中也均檢測到MaNPR1E的表達（圖4），表明MaNPR1E在香蕉組織中屬于組成型表達，根據這一結果推測，該基因可能在香蕉的生長和發育過程中起著重要作用。在擬南芥中，NPR1基因是調控植物抗病性的關鍵基因之一[2，6]，它不僅直接參與植物的系統獲得性抗性調控和其他類型的誘導抗病性，還在植物基因介導的抗病反應和植物基礎防衛反應中起著核心調控作用[1-2]。過表達AtNPR1基因能增強擬南芥對丁香假單胞菌和霜霉菌的抗性[6]；在缺失NPR1基因后，擬南芥植株易感這些病原菌[21]。在接種Foc后，MNPR1A在耐病品種的表達量高于感病品種[11]；接種FOC R4后，MdNPR1在抗病品種“Dongguan Dajiao”中的表達量高于感病品種“Fenjiao”[12]。在本研究中，接種Foc TR4后，MaNPR1E同樣在抗病品種中上調表達而在感病品種中下調表達（圖5），說明其可能參與了香蕉抗枯萎病的防衛反應。已報道的MaNPR1A、MaNPR1B和MdNPR-1基因均受外源水楊酸的誘導[11，13]，同樣MaNPR1-A和MNPR1B不受外源MeJA的誘導[11]，這與本研究結果相吻合。值得一提的是，在ISR建立的過程中茉莉酸和乙烯起著重要作用[12]。本研究結果表明，MaNPR1E基因明顯受外源乙烯利的誘導（圖6），表明香蕉MaNPR1E基因可能在乙烯介導的ISR中也起一定的作用。由此可見，該基因是否參與依賴于茉莉酸和乙烯介導的誘導系統抗性及如何提高香蕉的抗枯萎病能力值得深入研究。

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