化濁通脈方對動脈粥樣硬化兔主動脈小凹蛋白1及親環素A的影響

王曉寧,張艷虹,徐鳳芹

·基礎醫學論著////研究·

化濁通脈方對動脈粥樣硬化兔主動脈小凹蛋白1及親環素A的影響

王曉寧1,張艷虹1,徐鳳芹2

目的研究化濁通脈方對動脈粥樣硬化(AS)兔膽固醇跨膜逆轉運關鍵蛋白小凹蛋白-1(cav-1)及親環素A(Cyclophilin A)的影響,探討其通過促進膽固醇跨膜逆轉運抗AS的可能機制。方法40只新西蘭兔隨機分為空白對照組、模型組、中藥復方組、辛伐他汀組。采用單純高脂喂養法復制兔AS模型。造模、給藥15周后取胸主動脈,HE染色觀察各組動脈斑塊形成,蛋白印跡法(WB)測定主動脈壁內cav-1及親環素A表達量,實時定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)測定主動脈壁內cav-1及親環素AmRNA表達量,觀察實驗藥物對膽固醇逆向轉運相關蛋白及mRNA表達的影響。結果HE染色結果顯示,模型組兔胸主動脈管壁上粥樣斑塊形成明顯,各給藥組較模型組有不同程度的改善。WB結果顯示,與對照組相比模型組cav-1表達量明顯下降(P< 0.01),與模型組相比,辛伐他汀組cav-1表達增加(P<0.05),中藥復方組cav-1表達量也有增加趨勢,但無統計學意義;與對照組相比,模型組親環素A表達明顯增多(P<0.05),與模型組相比,中藥復方組及辛伐他汀組親環素A蛋白表達減少(P<0.01)。實時定量PCR結果顯示,與對照組相比模型組cav-1 mRNA表達量明顯減少(P<0.01),與模型組相比,辛伐他汀組及中藥復方組cav-1mRNA表達量明顯增加(P<0.01);模型組較對照組親環素AmRNA表達量減少,但無統計學意義,辛伐他汀組及中藥復方組較模型組相比親環素A mRNA表達量明顯增加(P<0.01)。結論化濁通脈方能夠通過適度調節cav-1及親環素A的表達,促進細胞內膽固醇流出,減少斑塊中親環素A的過度表達,減少AS血管壁內泡沫細胞及斑塊的形成,最終達到抗AS的作用。

動脈粥樣硬化;化濁通脈方;小凹蛋白-1;親環素A

動脈粥樣硬化(AS)發病機制尚不能明確。高膽固醇血癥是AS的一項重要危險因素,膽固醇逆向轉運(RCT)可使膽固醇從脂肪細胞中流出,轉運至肝臟代謝,最后經膽汁或其他途徑排出體外[1]。小凹蛋白-1(Caveo lin-1,cav-1)及親環素A是促進細胞內膽固醇流出至胞膜的重要蛋白[2,3]。本研究通過高脂飲食構建實驗兔AS模型,觀察化濁通脈方對AS兔胸主動脈管壁cav-1、親環素A蛋白及mRNA表達水平的影響,探討其抗AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 純種健康新西蘭大耳白兔40只,雄性,(8~10)周齡,體重2.275 kg±0.155 kg,中國醫學科學院實驗動物研究所提供,單籠飼養,9 d適應性喂養后進行實驗。

1.2 實驗藥物及特殊飼料 化濁通脈方顆粒劑由北京康仁堂藥業公司生產,由澤瀉、虎杖、草決明、郁金等共七味中藥組成;辛伐他汀片(商品名:舒降之),20 mg/片,杭州默沙東制藥有限公司生產;高脂飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司生產。

1.3 主要實驗儀器及試劑 電泳儀(Tanon,VE-

180),轉膜儀(Tanon,VE-186),定量PCR儀(StepOne PLUS App lied Biosystems),凝膠成像系統(JY04S-3C,北京君意東方電泳設備有限公司)。

1.4 模型制備與分組給藥方法 參照文獻配比高脂飼料[4],采用單純高脂喂養法建立兔AS模型。新西蘭兔40只,按隨機數表法分為4組,每組10只。空白對照組予普通飼料150 g/d;模型組予高脂飼料150 g/d。各組每日給藥量:中藥復方組由澤瀉、虎杖、決明子、郁金等共七味中藥組成,合計生藥6.5 g/(kg·d);辛伐他汀組合辛伐他汀1 mg/(kg·d)。連續喂養15周。

1.5 觀察項目及檢測方法 WB檢測cav-1/親環素A蛋白表達,采用化學發光試劑盒顯影,結果以X光片顯示。掃描儀收集圖像,并使用Quan tity One分析目標條帶及內參蛋白β-actin灰度值,做初步定量統計。實時定量PCR反應測定cav-1 mRNA/親環素AmRNA表達,PDH為內參對照,進行實時定量PCR反應。根據擴增曲線,設置空白對照組表達量為1,采用2ΔΔCt計算各組cav-1 mRNA及親環素A mRNA相對表達量。

1.6 統計學處理 采用SPSS17.0軟件分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示,有差異者采用LSD法進一步組間兩兩比較。

2 結 果

2.1 各組兔AS主動脈病理比較 空白對照組內膜光滑,內皮細胞層連續完整,平滑肌細胞排列整齊緊密有序,內皮下未見脂質沉積;模型組內皮層脫落,內膜明顯增厚,管壁內滿布斑塊,可見大量泡沫細胞,中外膜不規則增厚,可見泡沫細胞浸潤;中藥復方組及辛伐他汀組內膜均稍有增厚,管壁內皮細胞較連續,內膜下可見少量散在泡沫細胞沉積,未見明顯斑塊,中外膜與對照組厚度無明顯差異,較模型組薄。

2.2 各組動脈管壁組織cav-1及親環素A蛋白表達水平(見表1) 空白對照組動脈管壁組織豐富表達cav-1蛋白,模型組cav-1表達量明顯下降(P<0.01),中藥復方組cav-1表達量也有所下降(P<0.05);與模型組相比,辛伐他汀組cav-1表達增加(P<0.05),中藥復方組與模型組相比cav-1表達也有增加趨勢,但無統計學意義。

2.3 各組動脈管壁cav-1 mRNA及親環素A mRNA表達水平比較(見表1) 根據實時定量PCR結果繪制基因擴增曲線及熔解曲線,擴增曲線光滑,熔解曲線呈明顯單峰,各曲線峰值基本一致,說明產物單一,擴增產物特異性高。根據Ct值,以對照組為1,使用2-ΔΔCt方法計算各組基因的相對表達量。

表1 各組動脈管壁cav-1及親環素A蛋白及mRNA表達水平比較(±s)

表1 各組動脈管壁cav-1及親環素A蛋白及mRNA表達水平比較(±s)

組別小凹蛋白1親環素A蛋白表達量空白對照組1.275±0.3204)1.000±0.2674)1.013±0.1273)1.000±0.蛋白水平mRNA表達量蛋白水平mRNA 251模型組0.692±0.2522)0.480±0.1852)1.284±0.1571)0.969±0.226辛伐他汀組1.010±0.2013)0.861±0.3054)0.793±0.1061)3)1.596±0.4752)4)中藥復方組0.910±0.181 1.010±0.4352)0.799±0.2772)1.779±0.5462)4)與空白對照組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01。

3 討 論

化濁通脈方由澤瀉、虎杖、草決明、郁金等共七味中藥組成,是中國中醫科學院西苑醫院徐鳳芹教授結合多年臨床經驗,以濁、痰、瘀、毒為AS的病機基礎,總結出的防治AS中藥復方。方中以澤瀉利濕祛濁為君藥;虎杖清濕熱、散瘀毒,草決明潤腸通便從而使濁邪有分利之出路等為臣藥;郁金行氣通脈等為佐使之藥。是以化濁祛濕通絡為綱,佐以行氣、清化脂濁之藥,七藥并用,共奏化濁祛濕,散瘀通脈之功。對于AS患者降斑、穩斑及降脂方面均有較為良好的療效。前期基礎試驗研究亦表明,化濁通脈方可顯著降低AS兔膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白等指標。但目前,化濁通脈方抗AS的作用機制尚未明確,近年來,RCT成為抗AS研究的熱點,通過cav-1在內的多種蛋白參與,使細胞內膽固醇外流,機體排出過多膽固醇[5]。

小凹(caveo lae)是細胞膜表面的一種特異性的內陷微區,是信號傳導中心,與其他相關受體與蛋白協同膽固醇的跨膜逆轉運,亦是細胞內膽固醇流出的主要部位[6]。小凹蛋白(Caveo lin)是構成小凹的標志性核心蛋白[7],cav-1是Caveolin的家族成員,其在正常細胞中豐富表達,并參與許多重要的細胞活動,包括信號傳導、小泡運輸、調控膽固醇的胞內轉運、抑制腫瘤等,對維持細胞內膽固醇的動態平衡有著重要影響[8]。但同時,cav-1也是炎癥反應中心[9],過度表達的cav-1能促進炎癥反應,導致內皮增生,反而加重AS[10]。親環素A是一種胞質蛋白,屬于親免素家族,為胞內轉運體系主要復合物成分之一,cav-1與親環素A復合體作為轉運膽固醇的主要運載工具,參與膽固醇的正常轉運[11]。然而近年來大部分研究證實親環素A可促進炎癥反應,誘發內皮細胞損傷致血管炎癥反應,最終導致諸多心血管疾病,如AS、主動脈夾層、心臟肥大等[12-14]。

本研究通過病理形態學證明化濁通脈方能夠抗AS形成。模型組兔主動脈cav-1蛋白及mRNA表達量明顯下降;辛伐他汀組與模型組相比,cav-1蛋白及mRNA表達量明顯增加;中藥復方組與模型組相比,cav-1mRNA表達明顯增多,應促進cav-1蛋白生成,而cav-1蛋白水平雖高于模型組但無統計學意義,考慮可能原因為cav-1蛋白運載胞內膽固醇至胞外而使蛋白消耗。模型組兔親環素A蛋白水平明顯升高,中藥復方組及辛伐他汀組蛋白水平明顯減少,表明降濁通脈方及辛伐他汀可能通過抑制親環素A在斑塊內過度表達以減少炎癥反應。然而實驗結果顯示,各組親環素A的mRNA水平與蛋白表達水平卻成相反趨勢,考慮其原因可能為模型組形成的斑塊及炎癥反應促進了親環素A的蛋白質合成,使其表達增加,但尚未對基因水平有所影響;降濁通脈方和辛伐他汀促進親環素A基因表達,使其合成更多蛋白轉運復合體參與膽固醇轉運,使該兩組親環素A蛋白正常消耗而無過度表達。

本研究結果表明,降濁通脈方能夠通過提高cav-1及親環素A的基因水平,促進細胞內膽固醇流出,保障cav-1蛋白的正常表達,減少斑塊中親環素A的過度表達,最終達到抗AS的作用。

[1] 廖端芳,覃麗.小凹及小凹蛋白1:膽固醇逆向轉運與炎癥應答的共同分子平臺[J].中國動脈硬化雜志,2012,20(5):385-392.

[2] Le Lay S,Hajduch E,Lindsay MR,eta l.Cholestero l induced caveo lintarge ting to lipid drop lets in ad ipocytes:A role for caveolar endocytosis[J].Tra ffic,2006,7(5):549-561.

[3] Hayashi K,Ma tsuda S,Machida K.Invasion activating caveolin-1 mutation in human scirrhous breast cancers[J].Cancer Res, 2001,61(6):2361-2364.

[4] 符凌,常小榮.免疫損傷-高脂喂養法建立兔動脈粥樣硬化模型的方法與體會[J].中西醫結合心腦血管病雜志,2010,8:853-854.

[5] Ma rina C,Rader DJ.Macrophage reversecholesterol transpo rtkey to the regression of a the rosclerosis[J].Circu lation,2006, 113:2548-2555.

[6] 武明花,蘇琦.小凹-小凹蛋白的生物學特性[J].國外醫學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2003,24(6):337-338.

[7] Sowa G.Caveo lae,Caveolins,Cavins,and endothelial cell function:New Insigh ts[J].Front Physiol,2012,2:120.

[8] 何清,王長謙.小凹蛋白1在動脈粥樣硬化中的作用[J].中國動脈硬化雜志,2006,14(6):547-549.

[9] 廖端芳,覃麗,唐朝克.小凹及小凹蛋白1介導炎癥應答與膽固醇跨膜轉運之間的相互作用[J].中國動脈硬化雜志,2011,19 (3):233.

[10] 戴先鵬,熊國祚.Caveolin-1在炎癥反應中的作用[J].當代醫學,2012,18(9):29-31.

[11] 涂光輝,王北冰,嚴鵬科,等.親環素A在巨噬細胞荷脂過程中的表達及普羅布考干預的影響[J].中國動脈粥樣硬化雜志,2006, 14(4):293-296.

[12] 董曉蕾,李蓉,蔡輝.親環素A在心血管疾病中作用的研究進展[J].嶺南心血管病雜志,2012,18(4):444-447.

[13] Taguchi I,Abe S,Inoue T.Cyc lophilin A is a promising predictor of coronary artery disease[J].Circ J,2013,77:321-322.

[14] Satoh K,Nigro P,Zeidan A,eta l.Cyclophilin A promotes card-i ac hypertrophy in apolipopro tein E-de ficien tmice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(5):1116-1123.

Effects of Huazhuo Tongmai Decoction on Caveolin C1 and Cyclophilin A in Rabbit’s Aortas Atherosc lerosis

Wang Xiaoning,Zhang Yanhong,Xu Fengqin
Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

Xu Fengqin(Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medica l Sciences,Beijing 100091,China)

ObjectiveTo study the effect of Huazhuotongmaicompound on the key reverse transcription protein caveolin-1(Cav-1) and cyclophilin A of rabbits with atherosc lerosis(AS)and to investigate the possible mechanismof Huazhuo Tongmai decoction (HTD)in preventing AS through promoting reverse cholesterol transport(RCT).MethodsForty New Zealand rabbits were randomly divided into control group,model group,compound group and simvastatin group.The rabbits with AS were remodeled by feeding with simple hyper cholester old iet.The thoracic aortas were stripped for observation of artery plaque formation by HE staining after 15 weeks of drugs delivery.The Cav-1 and cyclophilin A in aortas was tested by Western blotting(WB)and the expression of Cav-1 and cyclophilin A mRNA in aortas was tested by Rea l-time PCR,which were designed to observe the effects of experiment drugs on proteins related to RCT proteins.ResultsThe results of HE staining show that there was markedly formation of atheromatous plaque on the wa llof thoracic aorta,while itwas improved in different degrees in medicated groups.The results of WB show that the Cav-1 in model group was significantly lower(P<0.01)compared with control group,the Cav-1 in simvastatin group was higher (P<0.05)compared with modelgroup,while there was no significant differences between compound groups and modelgroup(P> 0.05).The expression of cyclophilin A in the model group was significantly higher than that in controlgroup(P<0.05),and those in compound groups and simvastatin group were lower than that in mode l group(P<0.01).The same results of the expression of Cav-1 mRNA by Real-time PCR was alsofound,but there was no statistically significance in the exp ression of cyclophilin A mRNA in model group,which was lower than that in contro l group.The exp ression in compound group and simvastatin group were higher than those in model groups.ConclusionThe HTD can regulate the expression of Cav-1 and cyclophilin A,promote the outflow of cholesterol in cell,reduce excessive expression of cyclophilin A and formation of foamcells and atherosclerotic plaque,finally reach the anti-atherosclerotic effect.

Huazhuo Tongmaidecoction;atherosclerosis;caveolin-1;cyclophilin A

R543 R256

:A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.07.007

1672-1349(2015)07-0884-03

2015-01-18)

(本文編輯王雅潔)

1.北京中醫藥大學(北京100029);2.中國中醫科學院西苑醫院(北京100091)

徐鳳芹,E-mail:doctorxu@a liyun.com;xiaoning861126@126.com