高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜聯用測定生物樣品中的有機汞

王曉雯 王 煒 李玉璞

(大連市環境監測中心，遼寧 大連 116023)

汞是是自然界中常見的污染物之一，其毒性依賴于它的化學形態及其濃度，有機汞的毒性要比無機汞的強。其中甲基汞是有機汞中毒性最強的汞化合物之一。研究表明，在微生物的作用下，環境中的無機汞可以通過生物甲基化、乙基化、苯基化等反應生成相應的有機汞，而有機汞可被動植物吸收，并通過食物鏈富集，最終危害人類健康［1］。鑒于不同形態汞化合物的毒性差異，采用高靈敏度的形態分析方法測定環境樣品和生物樣品中汞的含量非常必要［2］。

目前，高效分離技術與高靈敏度的檢測技術聯用已經成為汞形態分析的主要手段。氣相色譜(GC)和液相色譜(HPLC)是常用的分離手段，原子熒光光譜(AFS)，原子吸收光譜(AAS)，電感耦合等離子體－原子發射光譜(ICP－AES)以及電感耦合等離子體質譜(ICP－MS)作為檢。測手段廣泛應用于汞形態的分析。其中HPLC－ICP－MS 以其靈敏度高、線性范圍寬、檢出限低等優點，成為各聯機應用分析汞形態的首選［3－10］。

分析生物樣品中的有機汞的前處理方法主要是以酸提取，堿消解和微波消解為主，使用HPLC－ICP－MS聯用技術進行分析，由于苯基汞需高比例有機相的洗脫，易造成ICP－MS 熄火，因此目前應用該方法進行汞的形態分析主要集中在甲基汞和乙基汞上，僅有曹程明［11］，彭國俊［12］和張蘭［13］等人在各自的研究中涉及到了生物體中的苯基汞，其中，只有曹程明在研究中做了苯基汞的回收率研究。本文在酸提取的基礎上，以苯作為萃取溶劑，用超聲輔助萃取，硫代硫酸鈉溶液作為反萃取劑進行樣品前處理，用HPLC 分離，ICP－MS 儀器增加了加氧裝置和有機專用矩管，建立了測定生物樣品中甲基汞、乙基汞和苯基汞的分析方法。所建立的HPLC－ICP－MS 方法在10min 內即可完全分離分析3種有機汞形態，大大縮短了樣品的分析時間，適合于生物樣品中汞形態的快速萃取分析要求。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Agilent 7500ce ICP－MS，配備加氧裝置和1.5mm有機矩管;Agilent 1200 HPLC;超聲波清洗器;離心機;振蕩儀;凍干機。

L－半胱氨酸(優級純);乙酸銨(優級純);苯(色譜純);甲醇(色譜純);濃鹽酸溶液(ρ=1.19g/mL);硫代硫酸鈉(c=0.01mol/L);甲基汞、乙基汞、苯基汞標準貯備液(ρ=10μg/mL)。

1.2 儀器工作參數

1.2.1 高效液相色譜參數設置

Agilent Zorbax Plus C18色譜柱，4.6mm×150mm，5μm;流動相:A 相為0.01moL/L 乙酸銨/0.12% L－半胱氨酸，氨水調節pH=7.5，經0.45μm 濾膜過濾;B相為甲醇。流動相流速為1.0mL/min，進樣量50μL;梯度洗脫，總時間為20min。洗脫條件見表1。

1.2.2 電感耦合等離子體質譜儀參數設置

入射功率1500W;采樣深度10.0mm;玻璃同心霧化器;石英霧化室與炬管;霧室采用半導體控溫于－5℃;Pt 采樣錐和截取錐;采樣模式:Time program．同位素:Hg202，積分時間0.5s。對應梯度洗脫條件分別設定最匹配的ICP－MS 儀器參數，梯度洗脫過程中采用合適的調諧文件，以保證梯度洗脫過程中各階段汞的靈敏度均最佳，氧氬混合氣比例見表1。

表1 液相色譜洗脫條件及質譜調諧文件設定

1.3 樣品的采集和前處理

取生物體的可食部分，依次用去離子水和超純水洗凈后，再用紗布拭干水分，打碎均勻后，然后置于凍干機冷凍干燥72h，充分干燥后粉碎成干粉儲存于密閉玻璃瓶中，冷凍保存。同時準確記錄凍干前后重量，并由此獲得樣品水分含量。

稱取0.2g 干樣品于50mL 的離心管中，加入10mL超純水，5mL 濃鹽酸和10mL 苯，超聲萃取25min，振蕩10min，5000r/min 離心10min，將上清液轉移至另一50mL 的離心管中。下層溶液加入5mL 苯，重復上述操作，合并上清液。加入5mL 硫代硫酸鈉溶液超聲萃取30min，離心，下層水溶液過膜進樣。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的選擇

王煒等在研究中使用Zorbax Plus C18色譜柱，乙酸銨/L－半胱氨酸，甲醇體系下，采用梯度洗脫程序進行3 種有機汞形態的分離［14］。經過研究比較，6min 之前均采用92%醋酸銨/L－半胱氨酸溶液+ 8%甲醇以便實現甲基汞、乙基汞的迅速分離，分離度與峰形均較為理想，在6min 后將甲醇比例直接提高至45%以實現苯基汞的快速洗脫。10min 內可以實現3 種有機汞的完全分離。在苯基汞分離之后，為保證下一個樣品的正常分析，11min 后恢復至92%醋酸銨/L－半胱氨酸溶液+8%甲醇體系，直至20min 樣品分析完畢。圖1 為濃度為10μg/L 的3 種有機汞形態的色譜分離圖，保留時間依次為甲基汞2.260min，乙基汞4.270min，苯基汞9.340min。

2.2 萃取溶液的選擇

曹程明在他的研究中采用鹽酸－甲苯為提取試劑，L－半胱氨酸溶液反萃取，前處理效果良好，甲基汞的回收率大于70%，乙基汞和苯基汞的回收率均大于50%［11］。由于甲苯為易制毒試劑，采購程序復雜，本研究使用苯替代甲苯作為提取溶劑。

2.3 反萃取液的選擇

圖1 3 種有機汞的譜圖

由于單純采用L－半胱氨酸溶液進行反萃取，乙基汞的回收率不穩定，而大多數研究均采用硫代硫酸鈉溶液反萃取，甲基汞、乙基汞和苯基汞的回收率較高［11］。

因此，本研究使用鹽酸－苯為提取試劑，超聲萃取后，硫代硫酸鈉溶液反萃取的樣品前處理方法，所得的甲基汞和乙基汞的回收率大于90%，苯基汞的回收率大于50%。

2.4 校準曲線的制備

用流動相配制濃度為0.50，1.00，5.00，10.0，50.0μg/L 的混合標準溶液，并進行測定。對不同濃度的甲基汞、乙基汞以及苯基汞所對應的峰積分面積作圖，線性范圍和回歸方程見表2。甲基汞、乙基汞和苯基汞均在0.50～50.0μg/L 范圍內呈現良好的線性關系，線性相關系數均大于0.9998。

表2 不同汞形態的線性范圍和回歸方程

2.5 方法檢出限、精密度和準確度

由于魚肉和貝類樣品中含有甲基汞，在檢出限的測定中，向0.2g 樣品中加入2.50ng 的乙基汞和苯基汞標準物質，另外加入25.0ng 的三種標準物質混合物做加標回收實驗。在上述條件下測定生物樣品，鹽酸－苯為提取試劑，超聲萃取后，硫代硫酸鈉溶液反萃取后，相應的萃取液濃度分別為0.50μg/L(乙基汞和苯基汞)和5.00μg/L，上機測試，平行測定7 次，做加標回收試驗，同時計算方法檢出限、精密度和準確度。魚肉中甲基汞的檢出限為0.030mg/kg，乙基汞的檢出限為0.013mg/kg 苯基汞的檢出限為0.010mg/kg;貝類中甲基汞的檢出限為0.038mg/kg，乙基汞的檢出限為0.019mg/kg，苯基汞的檢出限為0.015mg/kg。不同濃度樣品的相對標準偏差在1.6%－12.2%之間，兩個水平加標回收率在50.8～129%之間，結果見表3。

表3 樣品測定與加標回收試驗結果

3 結 論

本文采用酸提取法進行樣品前處理，并利用HPLC－ICP－MS 聯用技術建立了魚肉和貝類中汞形態的分析方法。在前處理方法和色譜、質譜實驗條件優化下，選擇以鹽酸－苯為提取試劑，超聲萃取后，硫代硫酸鈉溶液反萃取，以L－半胱氨酸為螯合劑，Plus C18柱分離汞化合物形態。將所建立的方法應用于生物樣品中的汞形態分析，靈敏度高，3 種有機汞的方法檢出限在0.010～0.038mg/kg 以內，以加標回收的方式研究了該方法對生物樣品的適用性，加標回收率在50.8～129%之間，兩個添加水平的回收率和精密度均能滿足日常分析需要，方法準確、可靠，為生物樣品中的汞形態分析測定提供了有用的參考。

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