合成生物學技術研究進展

呂永坤 堵國成 陳堅 周景文

（江南大學，無錫 214122）

合成生物學技術研究進展

呂永坤 堵國成 陳堅 周景文

（江南大學，無錫 214122）

合成生物學是一門將生物學工程化的應用學科，目的在于將生命元件標準化和模塊化；也可用于生命起源等基礎理論研究。對合成生物學進行了較為詳細地介紹，主要綜述了合成生物學領域新出現的方法及應用。

合成生物學；生物功能元件；無細胞合成生物學；最小基因組；定向進化；基因組編輯

合成生物學自誕生之日起就受到人們的廣泛關注。2006年，由美國國家科學院資助的合成生物學工程研究中心成立；2007年，歐洲委員會啟動了18項合成生物學領域的主要研究項目；英國也于2007年將合成生物學列為高優先級資助研究領域［1］。2008年，時代周刊將“創造生命”列為十大科學發現之一；2009年，英國皇家工程學院對合成生物學及其應用前景和影響進行了詳細介紹。同時，歐美紛紛向合成生物學研究領域投入巨資。另一方面，合成生物學的市場也在迅速擴張。BCC Research的研究報告認為，2012年和2013年合成生物學總的市場份額分別為21億和27億美元；到2018年，該市場份額將達到118億美元，且2013-2018五年間的復合年增長率為34.4%。

合成生物學起源于工程應用，其目的在于簡化復雜的自然生物系統，將其變為簡單、可靠、質量可控的模塊或者零件。這些模塊或零件可以使用計算機輔助設計（Computer aided design，CAD）來進行精確的預測和設計，可以進行不同的組合以獲得預期的功能，并且可以在工業規模進行生產制造［2］。合成生物學的快速發展得益于基因合成和測序等技術的進步。人工合成DNA價格的持續下降，使得經過密碼子優化的基因、啟動子及其他調控元件的使用更加廣泛，甚至出現了完全由人工合成的基因組［3］。高通量測序技術的快速發展使得測序的速度空前提高，測序成本也不斷下降，不斷有新的物種基因組數據被公開。基因元件功能表征和標準化是設計和構建具有新特征生物的關鍵步驟，越來越多的基因元件被構建和測試。

1 合成生物學及其起源

目前對于合成生物學有多種不同的定義，較普遍的觀點是，合成生物學的目標是設計和操縱生物基零件、裝置和系統，創造新功能甚至新物種，也可以對已有的天然生物系統進行重新設計。合成生物學是一門應用工程學原理進行系統設計的應用學科［9］。要理解合成生物學首先需要對其起源進行研究。關于合成生物學的起源目前有三種不同的看法：高通量化學合成DNA的實現；第一個基因計時器［10］和基因電路開關的構建［11］；以合成的基因元件構建完整的代謝通路。

如果將DNA的高通量化學合成作為合成生物學的開端，那么合成生物學其實是一種新的合成技術，為代謝途徑的構建和調控提供了一種簡單廉價的方法。化學法合成基因的長度和類型不斷擴展，如今已經可以實現小型基因組的合成［12］。如果以第一個基因計時器或基因電路開關的構建作為合成生物學的開端，那么合成生物學其實是一種基礎生物學問題研究的新方法。在這種觀點下，細胞被視為一臺設備，化學合成的DNA賦予其感受環境變化并以此調整自身的功能、生理和突變率［13］。這類基因控制元件有許多應用，可用以設計醫學治療的裝置［14］。由于存在巨大的工業化潛力，合成生物學在代謝途徑設計和構建中的應用可能是以上三種情況中最受關注的。然而，從理論的角度來講，該領域并無太大貢獻。因為研究者會認為，大多數所謂的合成生物學不過是在代謝工程中引入化學合成的DNA而已。

2 生物功能元件

正如電子工程相對于物理學一樣，合成生物學可以理解為生物學的工程化，而生物功能元件正是該工程領域的基本單元。通過理性設計，將不同功能特征的元件進行組合，可以得到具有新功能或新表型的生物體。實現這一目標需要依賴于對生物元件功能的表征、標準化、組裝和調試，以及對基因回路、底盤和整個體系的設計。

2.1 生物功能元件的設計、合成和功能表征

生命形態的多樣性，決定了生命系統可以合成幾乎所有現存有機化合物；遺傳信息的可編輯性，又提供了創造新的生命形態的可能性。生物功能元件是合成生物學的基石，是具有特定功能的最小生物元件，可以是氨基酸序列或核苷酸序列。不同的功能元件可以進一步被組合成具有更加復雜功能的裝置和系統。理論上，通過對生物功能元件的設計、組合，可以實現任何有機化合物和新物種的合成。另一方面，非天然氨基酸的使用、新核酸的開發及隨之而來的遺傳密碼子表的擴展，又可以進一步擴展化合物和新物種合成的范圍。隨著DNA合成技術的發展和商業化，基因元件合成的保真性和通量不斷提高，同時成本迅速下降，這為基因元件的大規模合成提供了基礎。另一方面，高通量篩選技術的普及，使得人們可以對大量基因元件進行高通量篩選和功能表征。

2.2 生物功能元件的標準化

隨著合成生物學的誕生，人們即在嘗試將生物功能元件標準化。1996年，Rebatchouk等［15］嘗試通過克隆技術建立一個標準的基因元件清單，但該研究并未立即引起廣泛的興趣。來自麻省理工學院的Kight于2003年提出了“生物磚”（BioBrick）的概念。隨后，大量的研究機構開始使用標準的生物磚元件來構建新的生物裝置和生物系統。生物磚是進行生物功能元件標準化的重要嘗試，可以將其理解為積木的單元，通過這些積木不同方式的組合，我們可以組裝出各種不同的結構［16］。通常生物磚元件應該包括基因的編碼序列和調控序列，如啟動子、核糖體結合位點和終止子等。由麻省理工學院于2003年成立的標準生物元件庫（Registry of Standard Biological Parts）目前收集了3 400件基因元件，用于組裝生物裝置和生物系統。這些標準的基因元件來源于學術研究機構、科學家個人和每年參加國際遺傳工程機器設計競賽（International genetically engineered machine competition，iGEM）的學生團隊。其中的每個生物元件都有自己的編碼，還包括其序列、創建者、功能及使用者等信息。這些信息都是公開的，可供免費使用。

2.3 生物功能元件的組裝

合成生物學的特點在于，可以對標準化功能元件進行組裝，以獲得不同功能的裝置和系統等。但是，由于生命系統的復雜性及人類認知的局限性，合成生物學往往不能像電氣工程等其它現代工程學科一樣，將特定功能的基因元件進行簡單的組裝，就可以獲得預期的結果［16］。在此過程中，需要對元件與元件之間、元件與裝置之間以及裝置與裝置之間進行適配和優化；同時，元件、裝置與底盤之間的兼容性也是重要的影響因素。在此過程中，高通量的測試方法和系統生物學的分析方法等都是進行適配和優化的有效方法。利用計算機輔助的動態模擬，在構建之前對系統進行建模、預測和優化，這樣可以減少系統測試的工作量，加快構建的速度［9］。如可以對各種組學數據進行整合、構建接近真實的生物系統模型、預測系統的功能及對環境擾動的響應，從而給出優化方案。

3 無細胞合成生物學

合成生物學試圖使用工程學方法來縮短設計-構建-驗證的工作周期，因為目前人工構建細胞的方法工作量極其巨大，且成本較高［17］。另一方面，人們對復雜生命活動認知的局限性，原有部分和合成（外來）部分之間的干擾，合成途徑的動態監控，這些都是目前胞內合成生物學（in vivo synthetic bilogy）所面臨的挑戰［16］，如表1所示［18］。由于不需要為細胞提供生長所需的輔助環境，無細胞合成生物學（cell-free synthetic biology）為解決上述問題提供了有力的支撐。無細胞合成生物學研究的是，不需要完整活細胞的條件下進行的復雜的生物學反應過程，這些過程是在體外進行的［19，20］。相對于胞內合成生物學，無細胞合成生物學的特點是，它是一個開放的反應體系。相對于胞內合成生物學，無細胞合成生物學具有許多優勢，如表1所示［21］。

作為基礎研究和應用研究工具，無細胞合成生物學已被研究了數十年，然而直到現在無細胞合成生物學用于工業生產才具有商業可行性，包括醫藥、代謝產物和非天然產物［22，23］。無細胞體外反應體系可以劃分為粗提物無細胞反應體系（Crude extract cell-free systems，CECFs）和合成酶途徑（Synthetic enzymatic pathways，SEPs）［17］。在選擇反應體系時，首先考慮的因素是需要保留的細胞“看家”功能（如持續提供能量）。構建SEPs所面臨的主要挑戰是人們對基礎生物學功能認知的局限性；而CECFs則經常發生不想要的反應或者產生某些未知產物。時間和成本也是需要考慮的因素。例如，在無細胞蛋白質合成過程中，重構SEP需要涉及能量代謝、呼吸、轉錄、翻譯和蛋白質折疊等，對于大多數商業應用，蛋白質的折疊都是價格高昂的。盡管SEPs和CECFs的應用有所重疊（圖1），但依然需要謹慎權衡二者之間的平衡［17］。以下為無細胞合成生物學的主要應用。

表1 胞內合成生物學所面臨的挑戰

3.1 蛋白質合成

無細胞蛋白質合成（Cell-free protein synthesis，CFPS）是無細胞合成生物技術最常見的應用。CFPS系統可以利用酶轉化細菌、植物或者動物細胞提取物。當在系統中提供必要的氨基酸和能量等時，這些活化的生物催化劑就可以催化氨基酸向多肽的聚合。大腸桿菌CFPS系統高效的蛋白質合成能力（＞1 g/L），使得商業化生產個性化蛋白質藥物［24］、疫苗［25］和難以胞內合成的蛋白質（如水解酶類）［26］成為可能。

3.2 代謝產物合成

在過去的研究中，人們開始意識到完整的代謝途徑也能夠在CECF系統中實現，包括中心代謝、三羧酸循環和氧化磷酸化等。根據這一思路，人們正在努力通過控制CECF生產代謝產物。Panke等［27］設計的CECF多酶催化系統，以葡萄糖為底物合成二羥丙酮磷酸（DHAP）。由于DHAP的不穩定性，可以直接向反應體系中添加丁醛和兔肌肉醛縮酶，將DHAP轉化為一種穩定形式。相對于CECFs，SEPs系統多用于小分子的生產［28］。SEPs的優勢在于理性設計生物合成網絡時的靈活性。Wang等［29］以纖維二糖為底物，通過一個12個酶的SEP系統合成了NADPH形式的氫。其中的纖維素二糖主要由酶解纖維素和稀酸預處理生物質水解物得到。在有酸處理的水解物存在的情況下，大腸桿菌是不能生長的。這一應用實例顯示了無細胞合成技術的優勢，即不需要滿足細胞生長的需求。

3.3 基因元件的構建

相對于在體內構建基因元件，體外方法具有獨特的優勢：反應條件的可控性和可預測性；大量的已知部件加快原型構建的速度；體外基因元件可以轉化為真正的基因模塊。得益于體外基因元件構建的快速發展，原型構建可以在1個工作日內完成；由4個基因開關組成的原型則可以在8 h內完成［30］。人們開發了諸多無細胞元件，包括邏輯門、存儲單元和振蕩器。其中，邏輯門包括AND、OR、NOR、XOR、NAND和NOT等；存儲單元有1-輸入雙推和2-輸入開關，以及諸多振蕩器。這些無細胞基因元件可以用于組裝最小人工細胞和細胞樣微裝置［18］。

3.4 擴展生命的化學結構

非天然氨基酸（Unnatural amino acid，uAA）摻入是無細胞合成生物學的又一強大工具，因為其允許其他的化學成分摻入到蛋白質中，從而可以擴展生命的化學結構。目前有兩種途徑可以實現uAA的摻入［31，32］。（I）殘基置換法：天然氨基酸類似物能夠被細胞內原有機制所識別，從而可以將天然氨基酸置換為相應的氨基酸類似物。該方法需要營養缺陷型宿主，且僅限于天然氨基酸類似物。（II）密碼子重置或終止密碼子消除法：該方法依賴于突變氨酰基-tRNA合成酶/tRNA對（Mutated aminoacyltRNA synthetase/tRNA，aaRS/tRNA）與uAAs的正交氨酰化，運送uAAs至蛋白質并被摻入。這兩種方法均在無細胞合成系統中獲得了成功。將新的化學物質引入蛋白質的特定位點具有很多種重要的應用，包括將藥物連接到抗體上用于臨床治療［33］，將蛋白質按特定方向固定到非生物材料表面［34］，生產功能性病毒樣顆粒［35］，探針和標記物摻入［36］等。

另一方面，研究者通過開發新的核酸來擴展遺傳密碼子表［20］。其中，Benner等通過重新定位胞嘧啶和鳥嘌呤中氫鍵的供體和受體，獲得了新的堿基對［異胞嘧啶：異鳥嘌呤（iso-C：iso-G）］。這導致了第65個密碼子——反密碼子對的出現，從而可以使uAAs在蛋白質體外合成過程中高效摻入。Benner等［37］對其工作進行了進一步的優化，創造了人工擴展遺傳信息系統（Artificially expanded genetic information system，AEGIS）。通過重置堿基上氫鍵供體和受體基團，將堿基數量由4個增加至12個。其中，堿基Z和P成為研究的焦點，二者不易受到氧化和差向異構的影響。在6堿基遺傳密碼子表（G∶C、A∶T、Z∶P）的基礎上，Benner等［38］進一步通過PCR反應擴增出了各種各樣的序列，其中包括多個連續非天然Z和P的序列。這是令人激動的成果，它說明這種擁有216種可能密碼子的非天然的遺傳密碼子表（ATGCZP）有可能被用于在體外合成生命［20］。

圖1 無細胞合成生物學的分類及應用

4 最細小基因組和最小細胞

構建人工細胞的關鍵是獲得最小基因組。最小基因組指的是在最優生存條件下，細胞維持生存所需要的最小的基因集合［39］。最小基因組可以作為特定功能的基因的載體被轉移到細胞底盤中，最終構建具有特定功能的最小人工細胞。細胞底盤指的是包含代謝系統的容器或分隔的空間，其中不包括遺傳信息或基因組。如果將基因組視為細胞的軟件系統，則底盤指的是細胞的硬件系統。最小細胞指的是，一定環境條件下，能夠維持生命活動的最小細胞單元，也可以理解為由最小基因組控制的自主復制細胞［39］。最小細胞不僅具有重要的應用價值，而且可用于研究地球生命的起源。值得注意的是，最小基因組和最小細胞均為相對的概念，因物種及其生存環境不同而異［40］。例如，當對兩個細菌的基因組進行比較時，得到的最小基因組由256個基因組成；當對100個基因組進行比較時，最小基因組的基因數減少至63；當對1 000個基因組進行比較時，最小基因組的基因數為0［41］。又如，寄生或共生微生物的某些基本生命活動（如氨基酸、維生素合成等）相關的功能基因在進化過程中被簡化掉了，因為這些微生物可以從寄主中直接獲取這些物質；另一方面，與其同源的非寄生微生物則保留有這些功能基因［42］。

最小基因組的研究方法包括比較基因組學方法、轉座子飽和突變法、反義RNA技術、單基因特異性突變法和基因組簡化法等［40］。這些方法均存在不足之處，目前無明確、統一的研究結果。在最小基因組研究初期，人們期望通過擴大研究的物種范圍，獲得一個相對于所有物種通用的最小基因組。然而，這種普適最小基因組可能并不存在［39］。有以下幾方面的原因。（1）在比較基因組學研究中，當物種及其環境多樣性足夠大時，人們所獲得的最小基因組的基因數為0，即并不存在所有物種必需基因的交集［41］。（2）某些生命必需的功能，在不同物種中由非同源的基因所編碼，在同一物種中也可能由多個基因發揮同一功能。如短RNA殘留物的降解被認為是必需功能，該功能由nanoRNases負責。nanoRNases在不同物種中有不同的來源（orn來源于Escherichia coli，nrnA和nrnB來源于Bacillus subtilis，nrnC來源于Bartonella birtlesii），且orn與nrnA或nrnB在序列上幾乎沒有相似性［43］；在Bacillus subtilis中則由兩個不同基因（nrnA、nrnB）所編碼，其中一個基因的失活不能導致細胞的死亡，因此可能被誤認為非必需基因；而在E. coli中，nanoRNases只能由orn編碼，因此無疑是必需的。（3）理論上，通用最小基因組概念的前提是所有生命起源于一個“最晚出現的共同祖先”（last universal commen ancestor，LUCA）［44］，即所有遺傳信息起源于同一套基因組。然而，LUCA事實上是一個初始細胞的群體，它們的基因組分別是古生菌、真細菌和真核生物的遺傳基礎。基因組的發展是在細胞進化的后期，在此之前已經出現了DNA復制、脂類合成和RNA降解相關的酶類的多樣性［45］。（4）以必需基因的集合作為最小基因組，那么最小細胞只能在最優條件下生存，而不能持續生存，尤其是當環境條件有所波動的情況下。

Acevedo-Rocha等［39］分析認為，通用最小基因組研究不成功的原因在于以必需基因的集合作為最小基因組；并提出以持續基因（Persistent gene）的概念來替代必需基因。持續基因指的是位于前導鏈上優先表達的基因，在細胞的長期繁殖（必需基因的功能）或細胞的自我維持、修復中發揮作用。基因組應當被劃分為兩部分：Paleome和Cenome。Paleome包括持續基因，與生長、復制、轉錄、翻譯、維持和衰老等關鍵功能有關。Paleome由大約500個持續基因組成，這些基因的功能包括：核心代謝，氨基酸、核苷酸、輔酶、脂類合成，細胞分裂，氨酰-tRNA合成，轉錄和翻譯。Paleome可被進一步劃分為持續必需基因和持續非必需基因。這些持續非必需基因被認為是可以省卻的，但實際上其與細胞的維持與壓力響應有關，消除后將導致細胞在環境波動時死亡。Cenome由非持續基因組成，這些基因負責細胞對特定環境的適應。因此，Paleome負責細胞在最優條件下存活，而Cenome負責細胞在特定自然條件下的長期生存。Cenome在同一物種的不同個體之間變換很大。例如，某E. coli的1 500個非持續基因（Cenome）與500個持續基因（Paleome）組成了該菌株的核心基因組（2 000個基因），而所有E. coli菌株的Cenome共包括18 000個基因［46］。

基因持續的概念在合成人工細胞時非常重要，因為按照必需基因概念構建的細胞只能在最優的環境條件下存活；而按照持續基因概念設計的細胞則可以在特定環境下長期生存，并能應對環境的波動。根據持續基因概念合成人工細胞應當包括如下步驟：（1）對細胞需要應對的環境條件進行評估；（2）根據環境條件對細胞進行理性設計，包括去除部分非持續基因、添加特定功能的基因，得到由paleome、簡化的cenome和特定功能基因組成的人工基因組；（3）基因的合成與擴增；（4）人工基因組在Saccharomyces cerevisiae中組裝；（5）人工基因組轉移到合適的底盤中（圖2）。

圖2 特定環境下具有特殊功能的最小細胞的合成策略

5 基因組編輯方法

在許多研究中，人們發現質粒分離、質粒上基因表達的不精確性以及質粒保持造成的代謝負擔等問題隨著質粒拷貝數的增加而加劇［47］。在基因組上整合表達顯然可以解決這些問題，且避免了抗生素和誘導劑等的使用［48］。由于細胞系統幾乎所有的功能都由基因組編碼，因此理論上基因組編輯可以重構生命系統［49］。在合成生物學的應用中，基因組編輯是異源合成途徑的重構及模塊優化的基本操作手段。傳統的定點重組酶系統如Cre/lox、PFlp/FRT和φC31等能夠實現對基因組的編輯，然而這些方法存在諸多不足，如重組效率低，篩選過程復雜，存在不利突變的可能性等。近年來出現的鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）、轉錄激活因子樣效應生物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和成簇的規律間隔的短回文重復序列（Clustered regularly int-erspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系統使得人們能夠高效、便捷且廉價地對基因組進行精確編輯。研究者既可以通過常規的分子生物學手段在較短的時間內構建這些系統，也可以購買商業化的試劑盒或者向生產商購買訂制的產品。

5.1 ZFN和TALEN

ZFN是第一個使用定制DNA結合結構域的核酸內切酶。ZFN是異源二聚體，其中每個亞基含有一個鋅指結構域和一個FokI核酸內切酶結構域。Cys2-His2鋅指結構域是真核生物中最常見的DNA結合基元。每個鋅指結構域在其保守的ββα構型中包含30個氨基酸，其中α螺旋表面的氨基酸識別基因組DNA上3-4個連續的核苷酸序列。經過設計和改造的鋅指結構域已經可以識別所有64個核苷酸三聯體；另一方面，鋅指結構域可以由連接肽串聯，從而可以識別9-18 nt的DNA序列。經過上述改造，鋅指蛋白理論上可以識別任意基因組上的任意目標序列［50，51］。Fok I為非特異性核酸內切酶，但鋅指結構域賦予其切割位點的特異性；Fok I結構域必須二聚化才有活性，確保必須存在兩個相鄰的DNA結合事件才能實現雙鏈斷裂，從而增加了切割特異性。在雙鏈斷裂后，細胞試圖修復它。最簡單的方法是非同源末端接合（Nonhomologous end joining，NHEJ），其中細胞基本上磨平斷裂DNA的兩端，再將其彼此拉近，這往往產生移碼。另一種方法是同源定向修復（Homology-directed repair，HDR）。細胞試圖利用另一條染色體上對應的DNA序列作為模板來修復斷裂。也可以通過提供特定的外源模板，對斷裂位點進行編輯。

TALEN也是二聚的轉錄因子/核酸酶，由轉錄激活因子樣效應物（Transcription Activator-like Effector，TALE）與FokI內切酶結構域融合而成。TALE是植物病原菌Xant-homonas的天然蛋白，其DNA結合結構域由一系列結構重復而成。每個重復結構包括33-35個氨基酸，且只能識別1個堿基。與鋅指結構域一樣，TALE也通過重復結構的串聯來識別特定的DNA序列；且通過不同的串聯組合，研究人員可靶定他們想要的任何序列［52］。TALE重復結構的串聯可以在數天內快速構建［53］。限于三聯核酸識別模式，ZFN構建困難且成本較高，而TALEN和CRISPR/Cas系統在這方面則具有相對優勢。

5.2 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas通過將入侵噬菌體和質粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應的CRISPR RNAs（crRNAs）來指導同源序列的降解，從而提供免疫性［54］。目前，在基因組定向編輯方面，運用最廣泛的是源自于生膿鏈球菌（Streptococcus hyogenes）的Type II CRISPR/Cas9系統。此系統的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（Trans-activating RNA）結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的基因組序列靶位點剪切雙鏈DNA，形成雙鏈缺口（Double strand break，DSB）。然后細菌通過非同源重組NHEJ或同源重組HDR兩種方式修復DSB［55］。近來，研究表明，通過人工設計的sgRNA（Short guide RNA）也可以引導Cas9對DNA的定點切割（圖3-A）［56］。

研究發現，Cas9蛋白不具有特異性，只需要一個特異識別基因組靶序列的sgRNA，即能實現對基因組靶序列核酸酶定向切割。人工合成的sgRNA一般包括3個部分（圖3-B）：靶序列互補配對區（Base-pairing region，20 nt）、Cas9蛋白結合區（Cas9 handle Region，42 nt）、轉錄終止區（S. hyogenes terminator，40 nt）。sgRNA引導Cas9蛋白識別基因組上的PAM（Protospacer adjacent motif）序列（S. hyogenes Cas9識別序列為NGG），并與PAM序列的5'端20個核苷酸序列互補配對，然后Cas9蛋白在PAM序列上游5'端第3個堿基處切割形成DSB［57］。由于CRISPR/Cas系統在基因組編輯上的高效、簡便，這一新技術目前被廣泛使用，并已成功運用于肺炎鏈球菌、大腸桿菌［58］、果蠅［59］、人類、小鼠、斑馬魚等［60］物種的基因組編輯。

6 定向進化

雖然我們已經可以從頭合成完整的細菌基因組及部分真核生物基因組，然而對于生命系統的認知依然有限，這使得我們在面對一些問題時并無太多策略。如異源表達蛋白質溶解度低、熱穩定性差，合成途徑中多個基因的協調性問題，在異源環境中基因元件功能的優化，基因組優化以使合成生命獲得預設的表型等［61］。定向進化并不需要我們預先了解太多生命系統的相關信息，從而成為解決這些問題的有力工具。本節主要介紹定向進化在合成生物學領域的應用及其新發展。

6.1 定向進化在合成生物學中的應用

定向進化指的是在實驗室條件下創造突變，并對突變文庫施加篩選壓力，從而篩選出具有期望表型的突變體［62］。定向進化實驗步驟包括創造隨機突變，將突變基因在合適的宿主中表達，以適當的篩選條件篩選有利突變。重復上述步驟，經過不斷的循環有利突變在較短的時間內快速積累，并可被用于后續操作以解決上述問題。定向進化可以在單分子水平實施，也可以在合成途徑和調控網絡水平實施，甚至在細胞整體水平實施以直接獲取某些特定表型［61］。

6.1.1 改善酶的催化特性 酶既是生命的基本元素，也可被單獨用于生物催化，來合成醫藥、化學品和能源。能夠在生產中應用的酶應當具有如下特性，催化活性高、底物特異性強、穩定。定向進化非常適合于提高酶的上述特性。PhlD被用于藤黃酚的生物催化合成，但PhlD的催化活性和穩定性均較差，成為限制其應用的重要因素。通過序列分析，Zha等［63］找到了PhlD的52個同源基因，并構建了容量為1.2×1011的突變體文庫。使用高通量篩選技術，篩選到了酶活性和穩定性均提高的突變體。來源于Methanococcus jannaschii的檸蘋酸合酶（citramalate synthase，CimA）在E. coli中表達活性較低。檸蘋酸途徑能夠使L-異亮氨酸缺陷型E. coli在基本培養基上生長，且細胞生長速率與檸蘋酸途徑的活性正相關。根據這一原理對CimA在L-異亮氨酸缺陷型E. coli中進行定向進化。經過6輪定向進化實驗，得到了1個活性提高且抗反饋抑制的CimA突變體。突變體使正丙醇和正丁醇的生產效率分別提高了9倍和22倍［64］。

6.1.2 非天然氨基酸摻入 當使用密碼子重置法將非天然氨基酸摻入蛋白質時，需要3個元件，即終止密碼子、tRNA和氨酰-tRNA合酶（aaRS）［65］。通過活性位點的改變，可以改變aaRS攜帶氨基酸的特異性，從而實現非天然氨基酸的摻入。通過定向進化，已經有70多種不同結構的非天然氨基酸摻入到細菌、酵母和哺乳動物的蛋白質中［32］。雖然非天然氨基酸的摻入可以使蛋白質的性質和功能發生變化，但同時也常常導致蛋白質活性和穩定性的下降。定向進化不僅可用于提高天然蛋白質的性質，也可用于提高攜帶有非天然氨基酸的蛋白質的活性和穩定性［66］。

圖3 Type II CRISPR/Cas9系統基因組編輯示意圖

6.1.3 基因表達水平調控 定向進化可以用于基因表達水平改造，如通過改造啟動子和構建操縱子來調控基因表達。對組成型啟動子PL-λ的衍生物進行易錯PCR，獲得突變體文庫。將突變體亞克隆至報告載體的綠色熒光蛋白GFP基因上游，并轉化E.coli。通過篩選，獲得了22個不同熒光信號強度的突變體。以這些突變體來考察磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶對細胞生長和脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶對番茄紅素產量的影響。另外，定向進化手段改造啟動子也可以用于S. cerevisae。為了同時調控多個相關基因，而又不分別對各自的啟動子進行改造，構建操縱子是比較方便的手段之一。為了調控操縱子內多個基因的表達水平，需要構建和篩選可調基因間區（Tunable intergenic region，TIGRs）文庫［67］。TIGR包括一系列控制元件，包括mRNA二級結構、RNA酶切割位點和核糖體結合位點（RBS）分隔序列（圖4）。以紅色熒光蛋白RFP和綠色熒光蛋白GFP作為報告系統，TIGRs可以使兩個報告基因的相對表達強度改變100倍。通過TIGR方法來平衡甲羥戊酸合成途徑中的3個基因的表達水平，可以使甲羥戊酸在E. coli中的產量提高7倍。

圖4 TIGR法調控操縱子中多基因表達水平［67］

6.2 定向進化的新進展

雖然定向進化是解決合成生物學問題的有力工具，但是其也受到文庫大小、篩選效率和進化實驗所需時間等因素的限制。不過，不斷出現的新方法已經可以用于緩解定向進化的這些限制，如智能文庫的構建、體內定向進化等。

6.2.1 智能文庫構建 在突變體文庫構建過程中，傳統的定向進化使用的是隨機突變的策略。在隨機突變產生的大量突變體中，有利突變往往并不占多數，但文庫容量的增加又增加了篩選的難度。而智能文庫指的就是容量較小且富含有益突變的突變體文庫。重構的進化適應途徑（Reconstructed evolutionary adaptive path，REAP）分析是構建智能文庫的方法之一［68］。REAP被用于擴展DNA聚合酶的底物譜。通過分析一系列DNA聚合酶在進化過程中的保守位點和可變位點，找到進行基因突變的位點。通過對93個突變體的篩選，得到兩個能夠高效利用新底物的突變體。相對于傳統的隨機突變文庫，從智能文庫中篩選出有利突變的效率極大地提高。當需要進化的對象的遺傳信息未知時，可以使用另一種被稱為截短的宏基因組基因特異性PCR的方法［69］。該方法將環境中的DNA按照功能進行篩選，接著使用一套引物擴增其中具有一定同源性的基因，從而得到一個具有功能和遺傳特異性的突變體文庫。

6.2.2 體內定向進化 體內定向進化策略可以簡化定向進化的實驗操作，并減少人為因素的干擾。噬菌體輔助持續進化（Phage-assisted continuous evolution，PACE）就是很好的例子［70］。在PACE實驗中，E. coli持續流經一個裝有復制性噬菌體的裝置，復制性噬菌體攜帶有目的基因。噬菌體要產生具有侵染力的后代需要pIII蛋白質，而研究者將噬菌體合成pIII蛋白質的能力與目標蛋白質的功能相偶聯。因此，當噬菌體感染流經的E. coli，并編碼具有功能的目標蛋白質時，可以產生pIII，進而產生具有侵染能力的后代噬菌體；當噬菌體編碼的蛋白質不具有功能時，pIII不能被合成，進而不能產生具有侵染能力的后代噬菌體。期間，噬菌體持續受到突變，并產生新的突變體。具有侵染能力的后代噬菌體不斷繁殖，而無侵染能力的后代噬菌體被洗出。最終，有利突變隨著具有侵染能力的噬菌體的富集而得到富集（圖5）。

基于邊突變邊進化的原則，李寅等提出了基于基因組復制工程的連續進化（Genome replication Engineering assisted continuous evolution，GREACE）的概念［71］。GREACE的原理是通過在微生物細胞中引入一系列經遺傳修飾的DNA聚合酶校正元件，使細胞進入一種高突變率的狀態，從而在篩選壓力條件下加速進化過程。經過一段時間的進化后，將遺傳改造的校正元件從細胞中移除，這時細胞就能維持其基因型的穩定，同時能將這種優勢表型遺傳下去。

圖5 PACE原理示意圖

7 合成生物學的應用

最初合成生物學發展的驅動力來源于對可再生性生物燃料的追求，人們期望通過合成自然界中不存在的生物，來將大量存在的糖類和纖維素物質轉化燃料。現如今合成生物學的應用已經擴展至很多領域領域，如生物燃料生產、天然產物合成、生物醫藥、合成新物種等。

7.1 生物燃料

石化資源的不斷枯竭及其燃燒產生的污染迫使人們尋求新的可替代清潔能源，通過微生物大規模生產生物燃料就是其中之一。如生物乙醇已經在部分國家實現商業化應用，而丁醇、異丁醇、生物柴油等物理化學性狀更優的生物燃料的應用也在探索中［72，73］。合成生物學使得人們可以將生物燃料的合成代謝途徑異位重構至性狀優良的微生物中，如Escherichia coli、Lactobacillus、Pseudomonas putida和Bacillus subtilis等。相對于傳統的生產菌，這些工程菌具有很多優勢，如生長迅速、營養要求簡單、易于遺傳改造和代謝副產物少等［74］。不過，生物燃料對微生物自身普遍具有毒害作用［75］，這也是人工合成微生物在高效生產生物燃料的過程中所面臨的最大挑戰。突變和遺傳改造等策略已經被應用于構建生物燃料耐受性菌株［76，77］，且生產過程表明其耐受性明顯提高。但是，人工合成微生物的生物燃料耐受性機制并不十分清楚，這成為阻礙理性設計耐受性更強微生物的最大障礙［74］。Kim等［78］和Lee等［79］針對這一基礎問題展開了研究，以期為提高生物燃料耐受性提供更加理性的策略。

7.2 天然產物

來源于動物、植物、真菌和細菌的次級代謝產物的性質與化學法合成的化合物差異很大。天然產物有著長期作為藥物使用的歷史，但是它們往往難以得到單一的化合物，且來源有限。與高通量測序技術及質譜分析技術等相結合，合成生物學將外源的代謝途徑引入易于遺傳改造的模式微生物中，實現了天然產物的高效生產。其中，代表性的天然產物包括青蒿素、黃酮類化合物等。Keasling及其團隊將青蒿中的紫穗槐-4，11-二烯合酶基因（ADS）導入大腸桿菌中表達，同時用酵母萜類合成途徑代替大腸桿菌萜類合成途徑，首次在微生物體內合成出青蒿素的第一個關鍵前體——紫穗槐-4，11-二烯［80］。而后他們又將ADS基因連同細胞色素P450單氧化酶基因（CYP71AV1）及其還原酶基因（CPR）同時導入釀酒酵母中表達，培育出世界上第一株生產青蒿酸的酵母工程菌［81］。國內江南大學研究團隊通過人工合成、密碼子優化及異源表達黃酮類化合物合成相關基因，實現了多種黃酮類化合物在大腸桿菌中的合成；通過模塊化策略，使圣草酚的產量達到107 mg/L［82］。

7.3 醫藥領域

合成生物學在醫藥領域的應用主要有體內文庫構建、藥物發現、藥物合成、藥物輸送和藥物優化等方面［83］。（1）體內文庫構建：將待篩選的化合物在細胞中表達，該文庫可以隨著細胞的培養而得到保存和擴增。（2）藥物發現：為了充分發揮體內文庫的優勢，可以利用顏色信號或者可篩選的遺傳表型等胞內分析方法來檢測和篩選陽性克隆。不斷增加的生物傳感器可以作為檢測工具。（3）藥物合成：通過合成代謝途徑的異位重構，一些重要的天然產物已經被成功合成，如萜類、聚酮化合物、非核糖體多肽、生物堿等。合成生物學還可以對這些合成途徑進行精確調控。（4）藥物輸送：通過合成生物學方法，可以理性設計微生物使其能夠作為藥物輸送的載體，且具有安全性。通過活體接種，這些攜帶藥物（如益生菌、抗腫瘤藥物等）的微生物侵襲特定的靶點（如腫瘤）［84］，在釋放前藥之后自毀。（5）藥物優化：蛋白質等藥物的修飾可以使其具有更好藥效和更長半衰期，通過在大腸桿菌中構建翻譯后修飾系統，使得大腸桿菌能夠生產經過特定修飾的重組藥物蛋白［85］。

7.4 新物種合成

2010年，Gibson等［3］將一個1.08 Mb的Mycoplasma mycoides人工合成染色體轉移到M. capricolum受體細胞中，創造出一個全新的M. mycoides細胞。該細胞完全由人工合成的基因組控制，并具有預期的表型特征，且能夠自主復制。這被認為是第一個人工合成細胞。不過，該細胞只能在最理想的環境條件下存活和自主復制，而不是在真正的自然環境中。關于真正的生命形式有不同的定義，因此，對于合成生命也就有不同的看法。一般的觀點認為，單細胞生命不僅僅包括其自身的生化和生理特性，還應當包括其所生存的環境條件，如主要的物質來源和能量來源、滲透壓、離子強度等［86］。自下而上的細胞合成一般需要滿足三方面的特征：遺傳信息、代謝和自組織。這三個特征對于具有自主復制和進化功能的合成生命是必不可少的［87］。雖然目前尚不能合成同時具有上述三個特征的生命形式，但合成生物學已經分別在這三方面取得了一定的進展［86］。

8 展望

雖然合成生物學研究已經取得較大進展，且有著很好的應用前景，但依然面臨諸多挑戰。2010年，Roberta Kwok在Nature雜志上撰文認為，合成生物學需要面對五大難題［9，16］：（1）大部分生物元件的特征尚不明確，我們不清楚它們在不同底盤或者不同實驗條件下的表型特征，甚至不知道它們能用來干什么；（2）功能回路的不可預期，即我們不能像其他現代工程技術一樣，將基因零件簡單的組裝起來就能獲得預期的功能；（3）系統過于復雜，即隨著系統的不斷擴大，構建和測試變得非常困難；（4）不兼容性，即外源的基因元件和底盤之間往往不兼容；（5）變異對于系統的影響，胞內分子具有波動性或噪音，這將影響細胞的功能，而這些隨機變異的積累將最終摧毀回路。生命是復雜而精密的系統，從轉錄調控、翻譯后修飾到代謝網絡之間的協調，以及細胞與細胞、細胞與外界環境之間的互動，這些都需要在特定的時間和空間上發生。對于生命認知的局限性是限制人們理性設計、構建和測試合成生命的最大障礙。人們對于不同元件、裝置和系統的構建和測試，使得生物合成相關的數據迅速擴增。對這些數據進行系統的整合，形成對生命系統較為完整的認知，是需要解決的問題和合成生物學的發展方向［1］。

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Advances in Synthetic Biology

Lü Yongkun Du Guocheng Chen Jian Zhou Jingwen
（Jiangnan University，Wuxi 214122）

Synthetic biology is an applied discipline that introduces engineering into biology. The aim of synthetic biology is to standardize and modularize biological parts. It can also be applied in the basic researches，such as the research of life origin. This review gives a detailed introduction to the synthetic biology，especially the new methods and applications.

synthetic biology；biological part；cell-free synthetic biology；minimal genome；directed evolution；genome editing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.017

2015-03-30

國家自然科學基金項目（31370130），江南大學自主科研計劃重點項目（JUSRP51307A）

呂永坤，男，博士研究生，研究方向：合成生物學；E-mail：lykun2012@sina.com

周景文，男，博士，教授，研究方向：合成生物學、代謝工程；E-mail：zhoujw1982@jiangnan.edu.cn