全細胞催化法生產N-乙酰神經氨酸的研究進展

張叢叢 陳彩霞 陳笑 溫雅 晏禮明 陶勇

（中國科學院微生物研究所，北京 100101）

全細胞催化法生產N-乙酰神經氨酸的研究進展

張叢叢 陳彩霞 陳笑 溫雅 晏禮明 陶勇

（中國科學院微生物研究所，北京 100101）

N-乙酰神經氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid，Neu5Ac）及其衍生物不僅在人體內發揮重要的生理生化功能，且已經應用到流感的預防和治療。但已有的N-乙酰神經氨酸生產方法產量低、成本高，限制了其大規模生產和廣泛應用。隨著分子生物學技術及糖組學研究的發展與成熟，一種新型的生物技術即全細胞催化法生產N-乙酰神經氨酸正成為研究的熱點。旨在介紹全細胞催化技術合成N-乙酰神經氨酸的研究進展。

N-乙酰神經氨酸；唾液酸；全細胞催化法；生物轉化

唾液酸（Sialic acid，SA）是一類Neu5Ac的O-乙?；苌铮?］，在微生物及哺乳動物體內大量存在［2］。迄今，分離鑒定的唾液酸類化合物已有40多種［3］，其中Neu5Ac約占整個唾液酸家族的99%以上［4，5］。少以游離形式存在，多連接在細胞膜表面的糖蛋白、糖脂或寡糖末端［6］。Neu5Ac是細胞信息傳遞的第一接觸位點［7］，且其分子結構具有多樣性，因此Neu5Ac參與細胞識別、信號轉導、腫瘤發生、受精等多個生理過程［8-12］。此外，Neu5Ac能調節IgG的抗炎活性，增強嬰兒免疫力，影響神經細胞的完整性、滲透性及活性，促進嬰兒大腦的發育［13-16］。以唾液酸為主體結構的一系列藥物已被用于癌癥、炎癥及流感的治療［17，18］。但現有生產方法產量低、成本高，難以滿足市場需求，因而建立經濟高效的生產方法成為研究熱點。

目前制備Neu5Ac的方法主要有：天然原料提取法、化學合成法、酶促合成法、生物轉化法及微生物發酵法等。19世紀60年代以來，研究者相繼從牛初乳、卵黃、酪蛋白和燕窩等SA含量相對豐富的天然材料中提取Neu5Ac［19-22］。但SA在天然原料中總含量低、分離提純過程復雜，導致其收率低、成本高、產物立體選擇性較差，難以實現工業化生產?；瘜W合成法多是在堿性或酸性條件下，由多種底物在催化劑的催化下合成，整個過程既需高溫、高壓等嚴苛的反應條件、復雜的生產工藝，還涉及復雜的基團保護、去保護問題；且反應過程中生成較多的中間產物及異構體，使產物后處理極其繁瑣，不能滿足工業化生產的要求［23-27］。此外，Neu5Ac還可通過水解微生物發酵的聚唾液酸得到。但此法產物濃度低，生長周期長，多伴有副產物，僅限于小規模試驗。生物合成法反應條件溫和、轉化率高、后處理簡單、專一性好、產品純度高，已逐漸取代傳統工藝成為新型“綠色”生產技術。隨著代謝工程、基因工程手段的發展，與基因工程技術相結合的全細胞催化法（whole-cell biocatalysis），已成為大規模生產Neu5Ac的最理想途徑。因此，本文將重點介紹近年來全細胞催化法生產Neu5Ac的研究進展。

1 全細胞催化法生產N-乙酰神經氨酸

全細胞催化法的基本原理是利用完整的生物有機體作為催化劑進行化學轉化，將某種前體分子轉化成特定產物，其實質是利用生物體系中酶的催化作用［28］。該方法主要是利用代謝工程原理，結合基因工程手段，對Neu5Ac代謝途徑進行改造進而實現產物的大量合成。主要手段包括在宿主細胞中過表達合成途徑中的相關酶蛋白，或敲除其降解途徑的相關酶基因，解除產物的反饋抑制。而該方法的主要依據是Neu5Ac在生物體內的多種合成途徑（圖1）。

圖1 Neu5Ac的生物合成途徑［29-32］

全細胞催化法合成Neu5Ac得以實現首先歸功于1986年Aisaka等的工作，他們首次從E.coli中克隆并表達出N-乙酰神經氨酸醛縮酶（N-Acetylneuraminic acid aldolase，NanA），揭開了全細胞催化法生產Neu5Ac的序幕。隨后，研究者相繼從多殺巴斯德桿菌?。≒asteurella multocida）、Bacteroides ovatus ATCC 8483中分別克隆出NanA、N-乙酰葡萄糖胺異構酶（GlcNAc 2-epimerase）［33-36］，并對其酶學性質進行了較全面的研究，促使全細胞催化技術不斷發展并日益成熟。迄今，全細胞催化技術經歷了多細胞偶聯和單細胞合成兩個階段。

1.1 雙細胞及多細胞偶聯系統

Tabata等［37］創造性地將全細胞催化法應用于Neu5Ac的合成。他們以E. coli NM522為宿主菌，分別克隆并過表達單細胞集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因（slr1975）、大腸桿菌（E.coli K-1）的Neu5Ac合酶基因（neuB），同時偶聯產氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes）并利用其代謝過程中產生的磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），共同合成Neu5Ac，構建了一個新型的微生物轉化系統（圖2）。該方法以800 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）和360 mmol/L葡萄糖作為起始反應體系，反應22 h后產生39.7 mmol/L（12.3 g/L） Neu5Ac，GlcNAc轉化率為5%。

雖然產物的產量較低，但這是首次在原核生物中克隆并表達出slr1975，為日后的研究工作提供了新思路。這種方法最大優點是利用工程菌的胞內酶，使整個反應在細胞內完成，前體物質GlcNAc經異源表達的專一性酶催化生成目標產物，實現了酶的級聯反應。該方法有效提高了合成效率，避免了繁瑣的酶純化過程，簡化了生產工藝，節省了ATP的添加成本，為工業化生產Neu5Ac提供了新的實驗依據。

圖2 多細胞偶聯催化合成Neu5Ac［37］

2007年，Xu等［38］提出了化學合成法與生物轉化法相結合的新方法。該方法綜合了細菌氧化乳酸生成丙酮酸的反應專一性與化學異構化合成ManNAc的高效性，建立了一種高效、經濟的復合式轉化系統。其利用E.coli K-12 的N-乙酰神經氨酸醛縮酶基因（nanA）與E. coli BL21構建了重組菌E. coli BL21（DE3）/pET15b-nanA，并與施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri SDM）相偶聯，形成雙細胞偶聯系統。施氏假單胞菌的乳酸氧化酶復合物（lactate oxidase，LOX）專一性地催化乳酸生成丙酮酸［39］，與化學異構化得到的ManNAc在重組細胞內協同合成Neu5Ac（圖3）。結果顯示，223.18 g/L GlcNAc及65.61 g/L乳酸生成18.32 g/L Neu5Ac，產量比Tabata等的研究結果提高了約50%，同時提高了GlcNAc的轉化效率，達到6%。

該方法的優點在于將化學合成與生物轉化相結合，一方面利用化學合成法高效快速地異構化GlcNAc產生高濃度的ManNAc，促使可逆反應向生成Neu5Ac的方向進行，提高了GlcNAc的轉化效率；另一方面，在重組菌中表達的NanA比E.coli K-12中的活性高約56倍，極大地提高了酶活性，有效提高了生物合成效率。而且生物轉化法能夠減少副產物的產生，使反應易于控制與操作。對于工業化生產，用低價的乳酸取代丙酮酸作為底物，極大地降低了生產成本。

圖3 化學合成法與雙細胞偶聯法相結合生成Neu5Ac［38］

同年，Lee等［40］研究發現魚腥藻屬（Anabaena sp. CH1）的N-乙酰葡糖胺異構酶（bGlcNAc 2-epimerase，bage）活性比豬腎的N-乙酰葡糖胺異構酶（pGlcNAc 2-epimerase，page）高11.5倍。因此構建工程菌時，他們將bage和E. coli K-1的nanA，分別導入宿主菌E. coli BL21，構建了兩株重組 菌E. coli BL21（DE3）/pET-bage及E. coli BL21（DE3）/pET-nanA，形成雙細胞偶聯的微生物轉化系統（圖4）［41］。由1 200 mmol/L GlcNAc和1 200 mmol/L丙酮酸作為初始反應體系，轉化12 h后，產物Neu5Ac終濃度高達122.3 g/L，生成速率為10.2 g/L/h，GlcNAc轉化效率達到33%。該方法的產量及轉化效率均較同期的全細胞催化法有大幅度的提高。該方法的另一個創新之處為該系統的工程菌細胞能循環使用8次，并且每個循環中Neu5Ac生成速率均維持在8.0 g/L/h以上。

該方法比較了不同的異構酶基因活性，運用高活性的異構酶促進了Neu5Ac產量顯著提高。同時，目標產物的生成速率提高了近5倍。這為后期提高Neu5Ac產量，實現大規模生產提供了新的實驗思路。更值得一提的是，該方法首次提出多次循環利用工程菌，縮短了生產周期，簡化了操作工藝，降低了發酵成本，使工程菌得到了最大程度的利用。但該方法仍存在需改進的工藝，其要求的底物濃度較高，較高的成本限制了工業化生產。

圖4 雙細胞偶聯法催化合成Neu5Ac［41］

2010年，Zhang等［42］在雙細胞偶聯法的基礎上，首次使用溫度誘導系統取代化學誘導系統。以E. coli K12作為宿主菌，分別用溫度誘導載體pBV220克隆表達Synechocystis sp. PCC 6803的slr1975以及E. coli K-1的nanA，以丙酮酸和GlcNAc為前體物質合成Neu5Ac。轉化36 h后，由200 mmol/L GlcNAc生成61.9 mmol/L（19.1 g/ L） Neu5Ac，轉化率達到30.95%（圖5）。雖然該方法的產量沒有明顯提高，但僅通過簡單地提高溫度來誘導表達相比于有毒性的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導更安全高效。該方法不僅保證了底物的高轉化率，也創新性提出了一種簡便安全、經濟有效的生產工藝，為安全化工業生產提供了有力的保障。

圖5 溫度誘導系統為特征的雙細胞偶聯法合成Neu5Ac［42］

微生物多細胞及雙細胞偶聯轉化系統的提出與發展，使得產量顯著提高，極大地推動了實現Neu5Ac工業化生產的進程。在此基礎上，不斷有人對Neu5Ac的合成，包括宿主菌、誘導系統、催化酶及供體基因進行研究和優化，使該工藝日臻完善，操作流程更簡單，反應條件更溫和，生產工藝更環保，生產成本更低廉。但由于多細胞及雙細胞偶聯系統常需兩種及兩種以上細胞作為載體，一方面難以維持系統的平衡以及細胞間的協調；另一方面細胞間傳質阻力會阻礙中間產物的轉運，降低了底物利用率。此外，系統中的副反應也在一定程度上降低Neu5Ac的產量。因此，為了克服細胞間的傳質阻力、解決系統間的協調與平衡、提高底物利用率，嘗試將整個合成過程在單細胞內實現成為研究者追求的目標。

1.2 單細胞合成系統

2010年Ishikawa等［43］在前期工作的基礎上，首次實現了單細胞合成Neu5Ac技術（圖6）。將slr1975、neuB基因導入E.coli構建重組菌E.coli N18-14/pLT4K，使其具備異構酶及合酶活性，從而在單細胞內完成整個合成過程。這有效地避免了傳質阻力引起的底物利用率降低。同時，敲除了nanA，使菌體喪失醛縮酶活性，防止Neu5Ac裂解。并且將工程菌用表面活性劑Nymeen S-215和甲苯處理，使之獲得高通透性，利于底物跟產物的胞內外轉運從而促進反應向合成方向進行。在GlcNAc用量為540 mmol/L（120 g/L）的體系反應22 h，產物濃度達172 mmol/L（53 g/L），產物生成速率為2.41 g/L/h，轉化率達32%。這是利用單細胞系統生產Neu5Ac的首創。

該技術與多細胞偶聯系統相比具有明顯優勢：首先，該體系僅由一種工程菌組成，更利于系統內的平衡與協調，也簡化了工藝過程；其次，減少了底物及中間產物在細胞間的傳遞步驟，提高了底物利用率；三是，隨著底物利用率的增加，Neu5Ac的產量明顯提高；四是，代謝途徑的進一步優化，減少了合成過程中的副反應，進一步促進了產物的積累；五是，應用單細胞體系，便于菌體的分離及循環利用，簡化了Neu5Ac的分離純化流程。另外，在反應體系中添加表面活性劑以增強細胞膜通透性，促進物質轉運，為后期研究提供了新思路，但尋求更加安全合適的表面活性劑將是研究者進一步探究的方向。

圖6 單細胞催化合成Neu5Ac［43］

2011年，Tao等［44］在前期工作基礎上結合單細胞合成法，進一步優化改造宿主菌的代謝途徑，建立了“one-pot”反應系統。首先敲除編碼葡萄糖特異PTS轉運體的基因（nagE），使磷酸轉移酶活性喪失，因此GlcNAc能夠直接進入Neu5Ac合成途徑。然后用溫度誘導載體pBV220將slr1975轉化到突變體E.coli K-12中，與nanA共表達，組成“one-pot”轉化系統（圖7）。該方法以溴化十六烷三甲基銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）作為表面活性劑，使Neu5Ac產量提高了一倍多。結果顯示，該系統36 h 能產生191 mmol/L（59 g/L）的Neu5Ac，產物生成速率約1.64 g/L/h。

該方法在保障高產高轉化率的前提下，以溫度誘導型質粒作為載體，以CTAB取代二甲苯作為表面活性劑，保證了生產過程的安全性。而且，由于大腸桿菌對CTAB的較高耐受性，能在一定程度上提高菌體效率，從而提高了整個系統的生產效率。

2012年，Kang等［45］在E. coli中 設計了一條以葡萄糖為唯一底物、以N-乙酰葡糖胺六磷酸（GlcNAc-6-P）為中間產物的Neu5Ac合成通路（圖8）。首先將Saccharomyces cerevisiae EBY100的葡萄糖-6-磷酸乙酰轉移酶基因（GNA1）、slr1975及nanA導入受體菌E. coli DH5α中共表達。同時過表達葡萄糖-6-磷酸合酶基因（glmS）解除其反饋抑制，并敲除nanE、nanK、nagA等基因以增加GlcNAc及ManNAc的積累；敲除丙酮酸在其他代謝途徑中的相關酶基因以保證丙酮酸完全進入Neu5Ac合成途徑而不被降解；敲除Neu5Ac向胞內轉運的基因nanT保證產物充分運輸到細胞外，促進反應向合成方向進行。最初該工程菌直接利用葡萄糖可產生1.62 g/L Neu5Ac，后經分批補料發酵產量可達7.85 g/L。

圖7 “one-pot”反應系統［44］

該方法利用菌體自身的代謝途徑并加以改造，實現了以葡萄糖為唯一底物合成Neu5Ac的愿景。雖然產量較低但用葡萄糖取代了GlcNAc、丙酮酸等高價的底物，極大地降低了生產成本，為開發更加簡潔高效的Neu5Ac合成途徑奠定了基礎。

圖8 以葡萄糖為底物的Neu5Ac合成途徑［45］

2013年，Sun等［32］研究了多順反子質粒上Nal與anAGE基因順序對Neu5Ac產量的影響。結果表明重組菌E. coli Rosetta（DE3） pLysS：pET-28a-Nal-anAGE合成的Neu5Ac產量最高。含0.8 mol/L GlcNAc與1.2 mol/L丙酮酸的反應體系產生了61.3 g/L Neu5Ac。該研究創造性的提出了基因順序對Neu5Ac產量有影響并得到證實，為進一步優化合成途徑提供了一定理論依據。

關于全細胞催化法合成Neu5Ac的最新報道是本研究組在大量前期研究的基礎上提出的一個更簡單高效的轉化系統（圖9）［46］。該系統以E. coli K-12為宿主菌，敲除nanTEK，導入age及nanA共表達，獲得重組菌E. coliΔ nanTEK/pNA。在此菌株中阻斷了Neu5Ac合成的競爭反應，保證ManNAc充分進入Neu5Ac合成途徑，同時使Neu5Ac不斷運出細胞促使反應向合成方向進行，結果0.6 mol/L GlcNAc 及0.8 mol/L丙酮酸的反應體系生成74.2 g/L Neu5Ac，產物生成速率達到6.2 g/L/h，轉化率高達40%。并且菌體可以回收循環利用5次。

該系統Neu5Ac的產量及產物生產速率均是目前報道的單細胞合成法最高值。其利用較低的底物濃度，獲得較高的產物生成速率，成為目前合成Neu5Ac最為理想的方式，進一步推動了全細胞催化法合成Neu5Ac實現工業化生產的進程。

圖9 優化后的Neu5Ac單細胞合成系統［46］

2 展望

在最近10多年中，依賴于基因工程與分子生物學技術的發展，Neu5Ac的全細胞催化合成與應用取得了引人矚目的成績和進步，已成為合成Neu5Ac的最理想方式。全細胞催化法作為對環境友好，低投資的前瞻性工藝路線，與化學合成法相比，全細胞催化法應用專一性的酶對前體物質進行專一性地酶促反應，副產物少，且反應條件溫和、污染低；與微生物發酵法相比，全細胞催化法生產周期更短，操作條件更容易控制，細胞或酶易再生、可循環使用，更適合大規模生產；與酶法合成相比，全細胞催化法在細胞內進行催化合成，能夠激活異構酶，還可省去繁瑣耗時的酶純化過程，并且生產過程中的反應是通過生命體自動調節方式進行，可充分利用微生物代謝產生的ATP，避免了添加昂貴的ATP，從而使反應過程更高效率、低成本、綠色環保。

迄今，Neu5Ac的合成工藝已日趨完善，但仍存在一定的改進空間。例如，尋找更高活性的合成酶，從而提高全細胞催化速率；設計更高效的合成途徑，構建更加穩定耐受的工程菌，最大程度上解除反饋抑制與競爭性反應，盡量減少副產物積累，提高工程菌的利用率；尋找更廉價的底物代替常用底物，降低生產成本；優化反應條件，進行工業化放大，建立一條簡便、安全、環保的生產工藝路線。因此，運用代謝工程、基因手段改造及篩選更合適的微生物催化劑仍是重要的研究課題。

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Advances in Production of N-acetyl-D-neuraminic Acid by Whole-cell Biocatalysis

Zhang Congcong Chen Caixia Chen Xiao Wen Ya Yan Liming Tao Yong
（Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

N-acetyl-D-neuraminic acid and its derivatives have versatile biological functions and considerable contribution in the therapeutics field. But the production and wide applications of Neu5Ac are limited by the low yield and high cost. With the development of Molecular Biology and the research of Glycomics, the production Neu5Ac by whole-cell biocatalysis, a novel type of biocatalysis, has attracted researchers’ attention. In this paper, we report that the advances in production of Neu5Ac by whole-cell biocatalysis, and also propose some guidelines for future studies.

N-acetyl-D-neuraminic acid；sialic acid；whole-cell biocatalysis；biotransformation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.020

2014-11-17

張叢叢，女，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：andrea718098@163.com

晏禮明，男，副研究員，碩士生導師，研究方向：生物工程；E-mail：yanlm@im.ac.cn

陶勇，男，研究員，博士生導師，研究方向：以代謝工程為基礎的新型生物催化劑開發與利用；E-mail：taoyong@im.ac.cn