補(bǔ)體成分C3及其缺失突變體蛋白的表達(dá)及與CLIC1蛋白共定位的研究

王二寧，陳丹丹，劉曉穎，范禮斌

補(bǔ)體成分C3及其缺失突變體蛋白的表達(dá)及與CLIC1蛋白共定位的研究

王二寧，陳丹丹，劉曉穎，范禮斌

摘要目的研究補(bǔ)體成分C3及其缺失突變體C3（1-840）、C3（824-1663）在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及與氯離子通道蛋白（CLIC1）的共定位。方法構(gòu)建pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒（缺失突變體根據(jù)C3的結(jié)構(gòu)域及其裂解斷裂位置設(shè)計(jì)），并分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中，Western blot檢測(cè)表達(dá)情況；上述質(zhì)粒分別瞬時(shí)單轉(zhuǎn)至COS7細(xì)胞和分別與GFP-CLIC1共轉(zhuǎn)至COS7細(xì)胞內(nèi)，觀察共定位情況。結(jié)果成功構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的C3基因及其兩個(gè)缺失突變體［C3（1-840）、C3（824-1663）］的真核表達(dá)載體，Western blot結(jié)果顯示它們?cè)贖EK 293T細(xì)胞中均能成功表達(dá)；免疫熒光顯示它們?cè)贑OS7細(xì)胞中均主要分布于細(xì)胞質(zhì)，且三個(gè)真核表達(dá)載體中只有C3（824-1663）與CLIC1有共定位。結(jié)論補(bǔ)體C3及其缺失突變體C3（1-840）和C3 （824-1663）在HEK 293T、COS7細(xì)胞中均能高效表達(dá)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，C3（824-1663）與CLIC1蛋白有共定位。

關(guān)鍵詞C3；轉(zhuǎn)染；基因表達(dá)；定位

2015-06-20接收

劉曉穎，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn；

范禮斌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn

補(bǔ)體是存在于血清及組織液中的一組具有酶活性的球蛋白，主要是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓、腹膜和肝臟等合成的一種β球蛋白［1］。補(bǔ)體系統(tǒng)由30多種血漿蛋白和血細(xì)胞受體組成，約占血清總蛋白的10%，其中補(bǔ)體成分C3（complement component，C3）在血清中含量最高，是在補(bǔ)體系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的成分［1］。人體內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)共有三條激活途徑，分別稱為經(jīng)典、旁路和甘露聚糖結(jié)合凝集途徑，三條途徑均是獨(dú)立的，但都需要經(jīng)過C3的裂解，激活途徑才能啟動(dòng)［2-3］。因此，C3是所有補(bǔ)體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的必需因子和匯合點(diǎn)［1］。從原始的脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了組成補(bǔ)體系統(tǒng)的有關(guān)成分如C3和B因子，同時(shí)也能檢測(cè)出補(bǔ)體活性［4］。因此，補(bǔ)體作為獨(dú)立的先天性免疫防御機(jī)制，出現(xiàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于特異性免疫，表明補(bǔ)體系統(tǒng)在進(jìn)化起源上比較早［5-6］。無(wú)論是先天性還是特異性的免疫都是無(wú)可替代的。

該研究通過構(gòu)建下游帶有FLAG標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒即pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG，然后分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T和COS7細(xì)胞中，來(lái)研究其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及其和氯離子通道蛋白（CLIC1）的共定位情況。

1　材料與方法

1．1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞含人C3全長(zhǎng)cDNA序列的質(zhì)粒由韓家淮教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，pcDNA3．1（＋）真核表達(dá)載體、TG1感受態(tài)菌株、COS7和HEK 293T細(xì)胞株均由本實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。

1．2主要試劑與儀器引物合成由上海生工生物有限公司完成，DNA Polymerase酶（日本TaKaRa公司），AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國(guó) Axygen公司），HindⅢ、XhoⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及Lambda DNA EcoR I＋Hind IIIMarker（加拿大Fermentas公司），DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清（美國(guó)Thermo公司）；Lipofectamine 2000 Reagent、Opti-MEM Reduced serum Medium（上海 Invitrogen公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠lgG和山羊抗小鼠IgG／TRITC（北京中杉金橋公司）；Western及IP細(xì)胞裂解液和一抗二抗稀釋液（中國(guó)上海碧云天公司）；Monoclonal anti-FLAG M2一抗（美國(guó)Sigma公司）；ECL顯色試劑盒（美國(guó)Pierce公司）；Leica DMI 6000型熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1．3方法

1．3．1質(zhì)粒構(gòu)建［7］根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)下游帶FLAG標(biāo)簽的C3及C3（-1840）和C3（824-1663）的引物，利用PCR法從含人C3全長(zhǎng)cDNA序列的質(zhì)粒中擴(kuò)增出C3及 C3（1-840）和 C3（824-1663），通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pcDNA3．1（＋）載體和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶16℃孵育13 h左右，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)8～10 h，挑取單克隆進(jìn)行搖菌，37℃恒溫培養(yǎng)12 h后抽提質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送公司測(cè)序。見表1。

表1　引物序列

1．3．2細(xì)胞培養(yǎng)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行傳代，并且以適當(dāng)密度接種至60 mm的培養(yǎng)皿中（不含雙抗培養(yǎng)基），待轉(zhuǎn)染。在熒光定位實(shí)驗(yàn)中，在30 mm培養(yǎng)皿中放入經(jīng)高壓滅菌、多聚賴氨酸包被的蓋玻片，充分晾干。同時(shí)，對(duì)COS7細(xì)胞進(jìn)行傳代，并以1×105～2×105／cm2的密度接種于鋪有蓋玻片的30 mm培養(yǎng)皿中，待轉(zhuǎn)染。置5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1．3．3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，待前一天接種的HEK 293T細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%的匯合度時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒提供的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，把培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；在熒光定位實(shí)驗(yàn)中，COS7細(xì)胞長(zhǎng)到30%～40%的匯合度即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1．3．4免疫熒光制片［8］轉(zhuǎn)染后約 24 h，取出長(zhǎng)有COS7細(xì)胞的蓋玻片，用PBS清洗；-20℃預(yù)冷的甲醇固定2 min，70%的乙醇固定5 min，PBS清洗3次，每次5 min；含1%脫脂奶粉的TBST溶液封閉30 min，棄封閉液；FLAG一抗（1∶100，用封閉液配制）室溫孵育2 h，回收一抗，PBS清洗3次，每次5 min；TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶1 000，用封閉液配制）室溫孵育1 h，棄二抗；PBS清洗3次，每次5 min；0．15 g／L DAPI溶液染核，室溫2 min，棄DAPI溶液；PBS清洗3次，每次5 min；濾紙盡可能吸去蓋玻片上的殘液，熒光封片膠（Dako）把蓋玻片封于潔凈載玻片上；4℃保存過夜，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。

1．3．5Western blot檢測(cè)C3及缺失突變的表達(dá)［9］轉(zhuǎn)染后約48 h，在冰上用細(xì)胞裂解液裂解HEK 293T細(xì)胞約30 min，然后4℃、14 000 r／min離心20 min，收集上清液；取出部分上清液加入等量2×SDS上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，冰浴3 min；SDSPAGE電泳2 h，100 V恒壓電轉(zhuǎn)1．5 h；取出PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，TBST清洗。FLAG一抗（1∶500，用一抗稀釋液稀釋）4℃孵育過夜，TBST清洗；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000，用封閉液稀釋）室溫孵育1 h，用TBST清洗；使用ECL試劑盒在暗室中用X線片曝光之后顯影和定影，X線片晾干后進(jìn)行掃描。

2　結(jié)果

2.1pcDNA3.1-C3-FLAG、pcDNA3.1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3.1-C3（824-1663）-FLAG真核表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)抽提的質(zhì)粒pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3 （824-1663）-FLAG分別進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示，以上質(zhì)粒都被切出兩條亮帶，經(jīng)過跟Marker比較，一條帶大小約為5．4 kbp，與載體pcDNA3．1的大小基本一致，另一條分別與各自的目的片段大小一致，表明連接成功，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

M：Lambda DNA EcoR I＋Hind IIIMarker；A：質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果；B：質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；1、2：pcDNA3．1-C3-FLAG的酶切鑒定產(chǎn)物；3、4：pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG的酶切鑒定產(chǎn)物；5、6：pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的酶切鑒定產(chǎn)物

2.2C3及其缺失突變體蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)情況對(duì)轉(zhuǎn)染了pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG和pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示裂解液都能檢測(cè)相應(yīng)的目的條帶，與預(yù)染的蛋白Marker進(jìn)行對(duì)比，pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG及pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的條帶與預(yù)期一致，即分別為187、105 和105 ku。表明C3及其C3（1-840）和C3（824-1663）在HEK 293T細(xì)胞中能夠正常表達(dá)。見圖2。

1、2、3：分別轉(zhuǎn)染pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG、pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG的HEK 293T細(xì)胞裂解液

2.3C3及其缺失突變體C3（1-840）和C3（824-1663）在COS7細(xì)胞中的定位COS7細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染pcDNA3．1-C3-FLAG、pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG和 pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)1．3．5中的方法進(jìn)行免疫熒光制片，熒光顯微鏡下觀察定位情況。結(jié)果表明三者均主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)幾乎沒有，但是pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG在細(xì)胞質(zhì)中靠近核膜一側(cè)有斑塊狀集中分布。見圖3。

2.4C3及其缺失突變體蛋白與CLIC1蛋白在COS7細(xì)胞中的共定位將C3及其缺失突變體分別與GFP-CLIC1共轉(zhuǎn)至COS7細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)1．3．5中的方法進(jìn)行免疫熒光制片，熒光顯微鏡下觀察定位情況。結(jié)果顯示，全長(zhǎng)C3和C3 （1-840）與CLIC1蛋白沒有共定位，但是C3（824-1663）與CLIC1蛋白有共定位現(xiàn)象，主要共定位在細(xì)胞質(zhì)中。有無(wú)共定位判斷依據(jù)是選擇兩種蛋白分布的同一個(gè)點(diǎn)或者位置進(jìn)行比較，觀察分布是否相同再通過疊加圖比較。見圖4。

3　討論

該研究通過構(gòu)建含有C3全長(zhǎng)基因及其缺失突變體C3（1-840）、C3（824-1663）的3個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T、COS7等真核細(xì)胞內(nèi)，通過免疫熒光和免疫印跡技術(shù)，檢測(cè)C3全長(zhǎng)基因及其缺失突變體C3（1-840）、C3（824-1663）在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位情況。根據(jù)文獻(xiàn)［10］報(bào)道，標(biāo)簽在上游有可能對(duì)蛋白表達(dá)產(chǎn)生一定影響，所以在基因的下游加入了FLAG標(biāo)簽。蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，Western blot檢測(cè)HEK 293細(xì)胞內(nèi)的C3及其缺失突變體C3（1-840）、C3（824-1663）蛋白都能正常表達(dá)。共定位實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光或者GFP融合蛋白表達(dá)的方法借助熒光顯微鏡觀察，若蛋白共定位，則作為該兩個(gè)蛋白有相互作用的一個(gè)佐證，從而推斷蛋白的功能，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，C3及其缺失突變體蛋白主要都定位在細(xì)胞質(zhì)中，共定位實(shí)驗(yàn)表明C3 （824-1663）與CLIC1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中有共定位現(xiàn)象，這將為研究C3這種大分子蛋白通過裂解形成片段與CLIC1相互作用提供一定的基礎(chǔ)。對(duì)于定位和表達(dá)選擇兩種細(xì)胞的理由是：一種是COS7細(xì)胞，該細(xì)胞特點(diǎn)是細(xì)胞核較大在熒光顯微鏡下觀察，能夠比較清晰觀察該重組蛋白在細(xì)胞中的分布；另一種是HEK 293T細(xì)胞，該細(xì)胞特點(diǎn)是細(xì)胞生長(zhǎng)快且轉(zhuǎn)染效率比較高，易于表達(dá)蛋白。

哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的主要功能包括宿主防御微生物，消除免疫復(fù)合物和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)適應(yīng)性的免疫反應(yīng)［11］。其中補(bǔ)體C3起著關(guān)鍵性作用，因?yàn)?條補(bǔ)體途徑的激活都要通過活化C3才得以實(shí)現(xiàn)［12-13］，C3在C3裂解酶的作用下進(jìn)一步裂解，參與許多補(bǔ)體的激活［11］。補(bǔ)體C3由A鏈和B鏈通過二硫鍵連接而成，C3基因位于第19號(hào)染色體，長(zhǎng)約41 kbp，編碼1 663個(gè)氨基酸。C3蛋白為187 ku，屬于α2-巨球蛋白家族（α2M）。C3為2個(gè)肽鏈結(jié)構(gòu)分別為α鏈和β鏈，由13個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成［11］：MG1-8、LINK、ANA、CUB、TED和Anchor。越來(lái)越多的研究［12］表明，許多疾病都與C3的變化有關(guān)。例如：抗原-抗體復(fù)合物引起的胃炎患者血清總補(bǔ)體和C3均明顯下降。大多數(shù)全身性紅斑狼瘡患者血清補(bǔ)體的降低和病情惡化有關(guān)，活動(dòng)性全身性紅斑狼瘡患者血清中C1、C2、C4和C3降低，病情緩解時(shí)血清補(bǔ)體水平恢復(fù)正常。腫瘤患者補(bǔ)體量升高，特別是肝癌，C3升高最為明顯，具有臨床診斷意義。因此對(duì)于補(bǔ)體成分C3的研究意義重大。

本研究結(jié)果表明補(bǔ)體C3及其缺失突變體在HEK 293T細(xì)胞中能夠正常表達(dá)，在COS7細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，只有缺失突變體C3（824-1663）與CLIC1有共定位。這將為本課題組在以后研究蛋白質(zhì)的相互作用提供依據(jù)。

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The expression of human com p lement component C3 and its deletion mutants and the colocalization w ith CLIC1

Wang Erning，Chen Dandan，Liu Xiaoying，et al
（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo study the expression and cell localization of complement component C3 and its deletion mutants C3（1-840）and C3（824-1663）in eukaryotic cells and the colocalization with CLIC1．MethodsTo construct three eukaryotic expression plasmids of pcDNA3．1-C3-FLAG，pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG and pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG（according to C3 structure domain and splitting position）．The plasmidswere transfected into HEK 293T cells．Then the expression was detected by Western blot，and their cellular localization was detected in COS7 cells by fluorescence microscopy．ResultsThe eukaryotic expression plasmids of pcDNA3．1-C3-FLAG，pcDNA3．1-C3（1-840）-FLAG and pcDNA3．1-C3（824-1663）-FLAG were constructed successfully，which could be expressed in HEK 293T and COS7 cells，and the cellular localization of C3 and C3（1-840），C3（824-1663）appeared similar，mainly in the cytoplasm，and only C3（824-1663）co-localized in the cytoplasm with CLIC1．ConclusionComplement C3 and its deletion mutants C3（1-840），C3（824-1663）can be effectively expressed in HEK 293Tand COS7 cells，and all of them aremainly distributed in the cytoplasm and C3（824-1663）co-localized in the cytoplasm with CLIC1．

Key wordsC3；transfection；gene expression；localization

中圖分類號(hào)Q 28；R 392．7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-1492（2015）11-1533-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（編號(hào)：81201368）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物教研室，合肥230032

作者簡(jiǎn)介：王二寧，男，碩士研究生；