定坤丹對子宮內膜異位癥模型大鼠的作用

何閏華，王文艷，衛　兵

定坤丹對子宮內膜異位癥模型大鼠的作用

何閏華，王文艷，衛兵

摘要自體子宮內膜移植法建立子宮內膜異位癥（EMS）模型大鼠，比較給藥前后移植物體積、大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平、異位內膜中血管內皮生長因子（VEGF）的表達。經定坤丹治療后移植物體積、血清TNF-α水平、異位內膜中VEGF的表達與疾病模型組相比均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0．05）。定坤丹對EMS模型大鼠的異位內膜生長有一定的抑制作用，其作用機制可能與血清TNF-α水平降低和VEGF的表達減少有關。

關鍵詞定坤丹；子宮內膜異位癥；腫瘤壞死因子-α；血管內皮生長因子

2015-06-18接收

衛兵，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：weibing1965＠ hotmail．com

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMS）在育齡期女性當中發病率為10%［1］，不孕、痛經、盆腔包塊為其主要癥狀。EMS的病因不清楚，發病機制主要有異位種植學說、在位內膜決定論、血管形成學說及免疫炎癥學說等［2］。治療上目前以腹腔鏡手術為主，術后輔以藥物治療來減緩復發。常用的藥物副作用大、遠期復發率高、部分藥物價格昂貴，因此需要尋找一種副作用小，患者易于接受，療效確切的藥物。王燕［3］采用定坤丹治療痛經及EMS的研究表明，其作用明顯，副作用小。關于定坤丹對EMS的作用機制尚無文獻報道。該研究使用定坤丹治療EMS模型大鼠，初步探討其作用機制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動物雌性未孕SD大鼠50只，清潔級，（200±10）g，購于安徽醫科大學實驗動物中心。動物飼養于安徽醫科大學動物實驗室，室內平均溫度25℃，平均濕度50%。

1．1．2藥品與試劑定坤丹（山西廣譽國藥有限公司）；達那唑膠囊（江蘇聯環藥業股份有限公司）；2%戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司）；慶大霉素（蕪湖康奇制藥有限公司）；苯甲酸雌二醇（寧波第二激素廠，獸用）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）ELISA試劑盒（武漢華美生物技術有限公司）；抗鼠血管內皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）抗體（美國Abcam公司）。

1．2方法

1．2．1大鼠 EMS模型的建立50只大鼠均在術前2 d給予苯甲酸雌二醇0．1 mg／（kg.d）肌肉注射，統一動情周期。10只作為正常組，另外40只按張麗雅等［4］自體子宮內膜移植方法建立模型。2%戊巴比妥鈉（0．2 m l／100 g）腹腔注射麻醉，關腹前每只大鼠腹腔滴入慶大霉素4 000 U消毒。術后第1天開始給予慶大霉素4 000 U／只腹腔注射，每日1次，連續5 d，苯甲酸雌二醇0．1 mg／kg肌注，隔日1次，共3次，促異位內膜生長。術后常規飼養。手術后4周再次剖腹探查，觀察移植部位有無移植物生長，測量其體積。

1．2．2模型檢測與納入標準異位子宮內膜組織在移植部位生長，形成圓形、透明或部分有咖啡色囊液的囊腫，囊腫周圍可見大量細小的新生血管，體積明顯增大，達8 mm3以上，病理見囊腫有子宮內膜腺體及間質即表示模型復制成功。

1．2．3實驗分組及給藥將造模成功的30只大鼠隨機分為模型對照組、定坤丹組、達那唑組。第二次手術1周后，腹部切口生長良好，飲食及二便正常后，各組開始灌胃給藥，藥物劑量根據《實驗動物學》，定坤丹組450 mg／200 g，達那唑組16 mg／200 g，正常組和模型對照組每只給予2 ml生理鹽水灌胃，每日1次，共4周。

1．3檢測指標用藥4周后取頸內動脈血，行血清學檢查，并再次開腹測量移植物體積，取移植物行免疫組化檢查。

1．3．1異位病灶體積測量第3次開腹測量異位灶體積。

1．3．2ELISA法檢測大鼠外周血清中TNF-α含量取大鼠頸內動脈血3 ml，離心（2 000 r／min，5 min）后取血清，按說明書進行操作。用酶標儀測定光密度值（optical density，OD），繪制標準曲線，通過標準曲線來計算樣品中TNF-α的濃度。

1．3．3免疫組化SP法檢測VEGF在異位內膜組織的表達取下異位內膜組織，所有標本經10%中性福爾馬林固定12 h。脫水，包埋，切片后按照SP試劑盒說明書操作。評分標準：根據陽性信號的強弱及陽性細胞的百分率綜合評分，每個樣本隨機選取5個不重疊高倍鏡（40×10）視野進行觀察。陽性信號為棕黃色或棕褐色，根據陽性信號的強弱評分；1分：無信號或信號很弱；2分：信號中等呈淡黃色或棕黃色；3分：信號很強呈棕褐色。根據陽性細胞的百分率評分，1分：陽性率≤20%；2分：陽性率21% ～70%；3分：陽性71%～100%。上述兩項評分相加作為每例的總積分。結果判斷在雙盲下進行，每張切片由兩位有經驗的病理醫師分別記數。

1．4統計學處理采用 SPSS 16．0進行統計學分析，數據以±s表示；移植物體積、血清TNF-α水平變化、VEGF的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2　結果

2．1移植物體積變化比較對移植物體積進行測量，給藥前，模型對照組、定坤丹組、達那唑組3組間無顯著性差異，給藥后，定坤丹組和達那唑組體積減小，體積要顯著小于模型對照組（F＝118．1，P＜0．05），見表1、圖1。

2.2血清TNF-α水平變化模型對照組血清TNF-α顯著高于正常組，分別用達那唑及定坤丹治療后，血清指標較模型組明顯下降，4組差異有統計學意義（F＝91．55，P＜0．01），見表1。

2.3VEGF的免疫組化結果與模型對照組比較，定坤丹及達那唑均能減少異位內膜組織中VEGF表達，差異有統計學意義（F＝39．69，P＜0．01），見表1、圖2。

3　討論

到目前為止，尚未有一種理論能完整解釋EMS的發病機制。經血逆流種植發生于約90%的育齡期女性，而EMS發生率不足10%；所以經血逆流只是EMS發生的起始環節，逆流至腹腔內的子宮內膜，需逃避腹腔內免疫細胞的清除，然后通過黏附-侵襲-血管形成才能發生發展。免疫炎癥與血管生成是 EMS兩個關鍵步驟［5］。

表1　不同組別間給藥前后體積、VEGF、TNF-α的比較（n＝10，±s）

表1　不同組別間給藥前后體積、VEGF、TNF-α的比較（n＝10，±s）

與同組給藥前體積比較：*P＜0．05；與模型對照組比較：＃＃P＜0．01；與正常組比較：▲P＜0．05

指標　　正常組　　模型對照組　　定坤丹組　　達那唑組　F值　P值給藥前體積（mm3）　-　87．20±4．24　89．00±7．75　87．60±6．38　0．226　0．799給藥后體積（mm3）　-　88．80±6．20　37．00±10．41*　37．70±8．80*　118．100　　＜0．001 VEGF（分）　-　4．00±0．67　1．80±0．63＃＃　1．90±0．56＃＃　39．690　　＜0．001 TNF-α（pg／m l）　60．8±8．9　136．5±14．7▲　84．7±9．1＃＃　87．5±7．5＃＃91．550　　＜0．001

腹腔內免疫及炎癥反應的改變導致EMS。TNF-α是由活化巨噬細胞分泌的一種細胞因子，其具有調節免疫、血管生成等作用。TNF-α能增加異位內膜細胞的侵襲功能［6］。TNF-α是重要的免疫調節因子，分泌適量的TNF-α促進免疫應答，清除異物。過量分泌則抑制免疫應答，導致異位內膜不能被免疫細胞清除，同時TNF-α促進異位內膜黏附、生長。從實驗數據可以看出，定坤丹明顯降低血清TNF-α水平，與模型對照組相比差異有統計學意義。

異位內膜的存活依賴新生血管形成。異位內膜組織及腹膜巨噬細胞分泌VEGF。研究［7-8］表明VEGF是最強的促血管生成因子，VEGF在EMS患者腹腔液中水平明顯高于正常婦女，VEGF刺激內皮細胞增殖、遷移，從而促進新生血管形成。周白等［9］發現無論是腹膜型還是深部結節型內異灶，其內異灶在血管化程度上無差別。本研究顯示與模型對照組相比，定坤丹顯著降低異位內膜中VEGF表達。

腹腔鏡下子宮內膜異位病灶切除手術治療EMS已成為一種趨勢，但術后復發的問題成為治療的難點。中醫認為EMS的發病機制為血瘀，定坤丹作為中醫婦科常用藥，其主要用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的婦科疾病［10］。EMS形成的關鍵步驟［腹腔免疫炎癥改變及異位內膜黏附-侵襲-血管（3A）形成］表明調節免疫炎癥及抑制3A形成的治療能取得較好療效。本研究提示定坤丹能抑制EMS模型大鼠的異位內膜生長，其作用可能是通過減少異位內膜黏附、侵襲、抑制異位內膜血管形成來實現的，這為臨床使用定坤丹治療EMS提供了實驗依據。

參考文獻

［1］Hayashi A，Tanabe A，Kawabe S，et al．Dienogest increases the progesterone receptor isoform B／A ratio in patients with ovarian endometriosis［J］．JOvarian Res，2012，5（1）：31-8．

［2］Kobayashi H，Higashiura Y，Shigetomi H，et al．Pathogenesis of endometriosis：The role of initial infection and subsequent sterile inflammation［J］．Mol Med Rep，2014，9（1）：9-15．

［3］王燕．定坤丹治療原發性痛經300例［J］．陜西中醫，2010，31（3）：278-80．

［4］張麗雅，裴磊，朱漢紅．重組人內皮抑素抑制大鼠子宮內膜異位移植灶的實驗研究［J］．中國婦幼保健，2013，25（28）：4229 -32．

［5］Hey-Cunningham A J，Peters KM，Zevallos H B，etal．Angiogenesis，lymphan-giogenesis and neurogenesis in endometriosis［J］．Front Biosci，2013，1（5）：1033-56．

［6］IslimyeM，Kilic S，Zulfikaroglu E，etal．Regression ofendometrial autografts in a ratmodel ofendometriosis treated with etanercept ［J］．Eur JObstet Gynecol Reprod Biol，2011，159（1）：184-9．

［7］Ren Q Z，Qian Z H，Jia SH，et al．Vascular endothelial growth factor expression up-regulated by endometrial ischemia in secretory phase plays an importantrole in endometriosis［J］．Ferti Steril，2011，95（8）：2687-9．

［8］Kianpour M，Nematbakhsh M，AhmadiSM，etal．Serum and perito-neal fluid levels of vascular endothelial growth factorin women with endometriosis［J］．Int JFertil Steril，2013，7（2）：96-9．

［9］周白，曹云霞，沙玉成．血管內皮生長因子與子宮內膜異位癥相關性的研究［J］．安徽醫科大學學報，2005，40（3）：255-7．

［10］劉丹卓，趙新廣，尤昭玲．定坤丹組方研究及臨床應用現狀分析［J］．世界中醫藥，2014，9（8）：1108-10．

Effects of DingKunDan on the endom etriosismodel rats

He Runhua，Wang Wenyan，Wei Bing
（Dept of Gynecology and Obstetrics，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601）

AbstractWe built ratsmodelof endometriosis applying autologus endometrial transplants to compare the graft volume of themodeling rats before and after dosing，serum tumor necrosis factor alpha（TNF-α）levels in rats，and the expressions of vascular endothelial cell growth factor（VEGF）in ectopic endometrium．To compare with the control group，the graft volume of DingKunDan group was reduced and the serum TNF-αlevel declined，and also the expression of VEGF in ectopic endometrium was reduced．Their differenceswere statistically significant（P＜0．05）．DingKunDan can inhibit the growth of ectopic endometrium in endometrosismodel rats．Themechanism may be related to the decrease of the serum TNF-αlevel and the VEGF expression．

Key wordsDingKunDan；endometriosis；tumor necrosis factor alpha；vascular endothelial cell growth factor

中圖分類號R 711．71

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1693-03

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：81100412）

作者單位：安徽醫科大學第二附屬醫院婦產科，合肥230601

作者簡介：何閏華，男，碩士研究生；