RACK 1及其缺失突變體與CLIC1的共定位研究

王蓓華，朱亮亮，劉曉穎，范禮斌

RACK 1及其缺失突變體與CLIC1的共定位研究

王蓓華，朱亮亮，劉曉穎，范禮斌

摘要目的運用分子克隆技術構建活化蛋白激酶C受體1（RACK1）突變體的真核表達質粒，進行RACK1突變體的表達、定位及其與胞內氯離子通道蛋白1（CLIC1）蛋白的共定位研究，為其進一步的功能研究奠定基礎。方法以RACK1全長cDNA序列為模板，構建真核表達質粒pcDNA3．1-RACK1-N（1-138）-FLAG、pcDNA3．1-RACK1-C（130-317）-FLAG；Western blot法檢測突變體在哺乳動物細胞中的表達；用免疫熒光技術了解突變體蛋白在哺乳動物細胞中的共定位情況。結果成功構建了RACK1突變體的真核表達質粒；Western blot法檢測到蛋白主要在胞質中表達，核內有部分表達；免疫熒光實驗表明，RACK1及突變體蛋白主要定位在胞質與核膜，細胞核中也有少量表達，與CLIC1蛋白存在共定位。結論成功構建了RACK1缺失突變體，并在真核細胞中成功表達；RACK1及突變體與CLIC1蛋白在哺乳動物細胞中均存在不同程度的共定位，蛋白之間可能存在相互作用，為RACK1蛋白的功能研究奠定了基礎。

關鍵詞RACK1；質粒構建；轉染；免疫熒光；Western blot

2015-06-15接收

劉曉穎，女，副教授，責任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn；

范禮斌，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn

活化蛋白激酶C受體1（the receptor for activated C kinase 1，RACK1）基因，開放閱讀框有1 142 bp，分子量為36 ku，由8個外顯子和7個內含子組成，編碼含317個氨基酸殘基組成的蛋白質［1-2］。RACK1的整體結構與G蛋白β亞基的色氨酸-天冬氨酸40（WD40）重復區域高度同源，也是WD40家族中的一員，最初發現［3-4］是由于其能結合并局部激活蛋白激酶C（PKC），不同的RACKs與不同的PKC同工酶相互作用，其中RACK1與βⅡPKC作用［5-6］。RACK1能與多種信號分子如胞外蛋白調節激酶（ERK）、應激活化蛋白激酶（JNK）、β整合素、離子型谷氨酸受體（NMDA）等相互作用，參與調控細胞免疫應答，細胞生長分化，腫瘤發生、發展等［7］。該研究將構建的突變體與野生型的表達及定位進行比較，了解RACK1及其突變體與胞內氯離子通道蛋白1（CLIC1）蛋白在哺乳動物細胞中的共定位情況，為進一步確定RACK1的具體功能區域奠定了基礎。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞系COS7、HEK 293T、真核表達載體pcDNA3．1（＋）、感受態E．coli TG1細胞均為生物實驗室保存。

1．1．2主要試劑pfu DNA polymerase（上海生工生物工程有限公司）；T4 DNA連接酶，DMEM高糖培養基（北京賽默飛世爾科技有限公司）；限制性內切酶HindⅢ、EcoRⅤ（加拿大Fermentas）；膠回收試劑盒（美國Axygen）；質粒提取試劑盒（美國OMEGA）；胎牛血清（美國 Hyclone）；LipofectamineTM2000、Opti-MEM（美國 Invitrogen）；Nuclear Extract （NE）buffer、Cytoplasmic Extract（CE）buffer、FLAG M2單抗（美國Sigma）；TRITC／FITC標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；熒光封片膠（丹麥DAKO公司）；PVDF膜（加拿大 BioBasic公司）；SuperSignal West Pico顯色試劑盒（美國Pierce公司）。

1．2方法

1．2．1缺失突變體序列擴增突變體的構建基于真核表達載體pcDNA3．1（＋），見圖1。根據目的基因序列和引物設計原則設計特異性PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，以RACK1全長cDNA序列為模板，以50μl PCR體系分別進行擴增，模板DNA10 ng，上下游引物各20 pmol，pfu DNA polymerase（5 U／μl）1μl。使用廠商推薦的PCR反應程序，最終產物由1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠回收試劑盒回收。

1．2．2缺失突變體的構建擴增產物分別用限制性內切酶HindⅢ、EcoRⅤ進行雙酶切，1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收試劑盒回收。酶切產物與相應的酶切載體經T4 DNA連接酶，于16℃連接過夜；連接產物分別轉化感受態細胞TG1，均勻涂布于含氨芐抗性的LB培養皿上，37℃倒置培養約12 h；挑取單克隆在含有氨芐抗性的LB培養基中37℃震蕩過夜；抽取質粒后雙酶切鑒定，將陽性克隆的菌液送公司測序。

1．2．3Western blot檢測蛋白表達及定位HEK 293T細胞和COS7細胞在5% 胎牛血清的高糖DMEM培養基中培養，LipofectamineTM2000與重組質粒的比例為1∶1。轉染48 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌1次，棄盡PBS，用5倍體積的CE buffer重懸細胞，冰浴并間隔震蕩5 min，3 000 r／min離心收集上清液，加等量2×SDS loading buffer，沸水浴5 min備用；余下沉淀用不含NP-40的CE buffer洗滌3次以除盡胞質蛋白，加入與沉淀等體積的NE buffer，冰浴并間隔震蕩10 min，3 000 r／min離心收集上清液，加等量2×SDS loading buffer，沸水浴5 min，SDS-PAGE膠電泳分離；100 V，濕轉1 h；室溫下PVDF膜在5%脫脂奶粉封閉液中孵育2 h，FLAG單抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST充分漂洗；二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST充分漂洗；ECL顯色試劑盒顯影。

1．2．4熒光定位COS7細胞在5%胎牛血清的高糖DMEM培養基中培養，轉染前1 d在35 mm皿中置蓋玻片接種一定數量的細胞，使得轉染當天細胞匯合度達50%以上。分別轉染野生型RACK1表達質粒及其缺失突變體，LipofectamineTM2000與重組質粒的比例為1∶1；轉染6 h后換正常培養基培養；24 h后固定細胞，FLAG M2單抗孵育2 h，TRITC／FITC標記山羊抗小鼠IgG孵育1 h，DAPI染核后，熒光封片膠封片；4℃存儲過夜，激光共聚焦顯微鏡觀察定位情況。

2　結果

2.1RACK 1缺失突變體的構建與鑒定擴增的PCR產物和載體經過雙酶切后產生相同的粘性末端，通過連接酶連接，形成重組質粒，其中僅含有單個酶切位點，如果構建成功，酶切鑒定時會在相應位置出現目的條帶，見圖2。測序結果進一步證實目的片段正確插入到pcDNA3．1（＋）載體中。

2.2RACK 1及其缺失突變體在細胞核、細胞質中的表達轉染48 h后，收集細胞，Western blot法檢測蛋白表達，見圖3。A、B圖分別為野生型和突變體在細胞核、細胞質中的表達結果，與目的蛋白分子量一 致，即RACK1-FLAG、RACK1-N-FLAG和RACK1-C-FLAG的分子量分別為36、16和21 ku。由于野生型RACK1和突變體RACK1-N在HEK 293T細胞中正常表達，突變體 RACK1-C在HEK 293T中表達過低（免疫熒光實驗顯示在HEK 293T中也能夠表達，數據未顯示），所以這里用COS7細胞進行RACK1-C的蛋白表達實驗。

2.3RACK1缺失突變體在COS7中的定位轉染24 h后經激光共聚焦顯微鏡觀察，見圖4A。野生型RACK1主要在胞質中表達且存在斑塊狀分布，核膜處表達增多，細胞核中也有部分表達；缺失突變體pcDNA3．1-RACK1-N和pcDNA3．1-RACK1-C主要在胞質中呈斑點狀分布，細胞核中也有少量表達，野生型與突變體蛋白在COS7細胞中的定位未發生明顯變化。RACK1及其缺失突變體質粒分別與CLIC1質粒共轉入COS7中，結果見圖4B。CLIC1在胞質、胞核及核膜處均有明顯的表達，與RACK1及缺失突變體均有有共定位存在。

3　討論

本研究將RACK1突變體（N端和 C端）構建于真核表達載體pcDNA3．1（＋），分別轉染至HEK 293T和COS7細胞中，初步了解其在真核細胞中的表達和定位。結果顯示，野生型RACK1主要分布在胞質與核膜處，細胞核中有少量表達；缺失突變體pcDNA3．1-RACK1-N和pcDNA3．1-RACK1-C主要呈斑塊狀分布于細胞質，細胞核中表達較少，突變體和野生型的細胞定位未發生明顯變化；野生型RACK1及其兩個突變體與CLIC1蛋白均存在部分共定位，提示蛋白之間可能存在相互作用。本實驗室已經通過其他實驗證實野生型RACK1蛋白與CLIC1蛋白存在相互作用（數據未發表）。

接下來將RACK1及其兩個突變體構建到原核表達載體pGEX-5X-3中，誘導GST融合蛋白表達，進行GST-pulldown實驗，并結合co-IP實驗進一步驗證RACK1突變體蛋白與CLIC1蛋白是否存在相互作用。

互作蛋白能夠特異性結合RACK1特定的WD區域，如PKCβ、Src、PDE4D5、干擾素受體等的結合區域都在WD5-7范圍［8］，該區域屬于功能區域。本研究所構建的突變體RACK1-N包含了WD1-3區域，突變體RACK1-C涵蓋了WD5-7區域，為后續RACK1的功能研究、確定與其互作蛋白結合的精細結構等研究奠定了基礎。研究［9］表明RACK1參與離子通道的功能，pkd2L1能夠通過Ca2＋、Na＋、K＋，是一種非選擇性的陽離子通道，RACK1的WD6與WD7結構域能夠與pkd2L1的Ala19-Pro45片段相互作用。在中樞神經系統中，RACK1可與GABAA受體（GABAAR）的胞漿區結合［10］，GABAAR是一種配體門控氯離子通道，所以對RACK1是否與胞內氯離子通道蛋白相互作用具有一個很好的提示。本研究中的免疫熒光實驗結果證實RACK1及其突變體蛋白與氯離子通道蛋白1（CLIC1）存在共定位，提示蛋白之間可能存在相互作用。RACK1蛋白表達廣泛，有100多種蛋白與RACK1相互作用，這些蛋白絕大多數已證實作為RACK1的結合伴侶，通過RACK1進行功能調節［11-14］。關于RACK1和CLIC1結合的生理功能研究有待進一步探索。

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The co-localization of RACK1 and itsmutants w ith CLIC1

Wang Beihua，Zhu Liangliang，Liu Xiaoying，et al
（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjective To construct the eukaryotic expression plasmids of the receptor for activated C kinase 1

（RACK1）mutants using molecular cloning techniques and observe the expression and cellular localization of RACK1 mutants and their co-localization with chloride intracellular channel protein 1（CLIC1）for further study on the cellular functions of RACK1 protein．MethodsRACK1 mutants were amplified by PCR with the template including the full length cDNA fragment of RACK1．Eukaryotic plasmids pcDNA3．1-RACK1-N（1-138）-FLAG，pcDNA3．1-RACK1-C（130-317）-FLAG were constructed respectively．The cellular expression and localization of RACK1 and itsmutants inmammalian cellswere detected byWestern blotand confocal fluorescencemicroscopy respectively．Resu ltsAll the plasmids of RACK1 mutantswere successfully constructed．Western blot and confocal fluorescencemicroscopy results indicated that RACK1 and itsmutants localized both in cytoplasm and nucleus，mainly in cytoplasm．The co-localization existed between RACK1 and CLIC1，and themutants of RACK1 had similar co-localization with CLIC1．ConclusionRecombinant plasmids of RACK1 mutants are constructed successfully and express effectively in eukaryotic cells．RACK1 protein and itsmutants appear to co-localizewith CLIC1 respectively，which implies that RACK1 and itsmutantsmay interact with CLIC1 respectively in mammalian cells．The study is very important for exploring the function of RACK1．

Key wordsRACK1；recombinant plasmids；transfection；fluorescence；Western blot

中圖分類號R 349．65；R 349．83

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1543-05

基金項目：國家自然科學基金青年基金（編號：81201368）

作者單位：安徽醫科大學生命科學學院生物學系，合肥230032

作者簡介：王蓓華，女，碩士研究生；