甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲減大鼠海馬內超微結構及synaptotagm in-1表達的影響

查小雪，蔡瑤俊，吳章碧，吳　波，賈雪梅，朱德發

甲狀腺素聯合多奈哌齊對成年期甲減大鼠海馬內超微結構及synaptotagm in-1表達的影響

查小雪1，蔡瑤俊1，吳章碧1，吳波1，賈雪梅2，朱德發1

摘要目的觀察甲狀腺素（T4）聯合多奈哌齊（DON）治療對成年期甲狀腺功能減退癥（簡稱甲減）大鼠海馬內超微結構及突觸結合蛋白synaptotagmin-1（syt-1）表達的影響。方法飲0．05%丙基硫氧嘧啶（PTU）水建立成年期大鼠甲減模型共6周，第5周起，T4治療組給予腹腔注射T4 6μg／100 g體重、DON治療組飲0．005%DON水，聯合治療組給予T4 ＋DON治療，對照組及甲減組每日腹腔注射等量生理鹽水。采用放射免疫法測定血清甲狀腺素水平，透射電鏡觀察海馬內超微結構，Western blot方法分析海馬內syt-1的表達水平。結果甲減組、DON治療組大鼠血清甲狀腺激素水平明顯降低（P＜0．01），T4治療組、聯合治療組與對照組差異無統計學意義；電鏡下甲減大鼠海馬內神經元中線粒體呈現明顯空泡變性、游離核糖體稀疏、突觸結構受損、突觸小泡數量減少，T4或DON治療后上述損傷有所改善，而聯合治療恢復后表現最接近對照組；甲減大鼠海馬內syt-1蛋白表達量明顯降低（P＜0．01），單獨T4或DON治療后表達仍下降（P＜ 0．05），聯合治療后syt-1表達恢復正常。結論成年期甲減可致大鼠海馬內超微結構發生病理學損害，syt-1蛋白表達下降，T4＋DON治療有利于上述損傷的修復，作用優于單一藥物治療。

關鍵詞甲狀腺功能減退癥；海馬；超微結構；synaptotagmin-1；甲狀腺素；多奈哌齊

2015-05-06接收

2安徽醫科大學基礎醫學院綜合實驗室，合肥230022

朱德發，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：zdfa0168 ＠sina．com

成年期甲狀腺功能減退癥（簡稱甲減）可引起一系列中樞神經系統結構和功能的損害［1］。海馬作為中樞神經系統中與認知、情感等功能密切相關的區域，其神經元是甲狀腺素作用的靶點［2］。成年期甲減可導致海馬形態結構和功能的損害［3］，其機制可能涉及神經元間聯系和突觸可塑性，是多種突觸蛋白參與的復雜生理過程。Synaptotagmin-1（syt-1）是突觸囊泡包膜蛋白，在神經元內表達豐富，主要分布于小突觸囊泡和大致密囊泡表面，通過調控突觸囊泡的循環再利用參與突觸傳遞的全過程，促進神經遞質的釋放，與學習和記憶有關［4］。以往的研究［5］表明成年期甲減能導致syt-1蛋白在海馬內表達下降，然而給予生理劑量甲狀腺素（thyroxine，T4）替代治療至血清甲狀腺激素水平正常后，syt-1蛋白的表達卻未能完全恢復。多奈哌齊（donepezil，DON）是一種膽堿酯酶抑制劑，能有效改善認知和記憶障礙［6］，對于甲減引起的海馬損害可能也具有一定的治療效果。該研究采用飲丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）水制備甲減大鼠模型，觀察大鼠海馬內超微結構及syt-1蛋白表達的情況，并評價LT4聯合DON的治療效果。

1　材料與方法

1．1主要試劑PTU、四碘甲狀腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）、DON（美國Sigma公司）；三碘原氨酸（triiodothyronine，T3）、T4放射免疫試劑盒（北方生物技術研究所）；兔抗大鼠抗syt-1蛋白多克隆抗體、兔抗大鼠抗GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋有限公司）；ECL化學發光試劑盒（美國Pierce公司）。

1．2動物模型復制健康雄性SD大鼠40只，3月齡，SPF級，230～260 g，購于安徽醫科大學實驗動物中心。所有大鼠給予標準飼料喂養，自由飲水，溫度21～23℃，濕度（50±5）%，晝夜均衡。適應性喂養1周后，將SD大鼠隨機分為5組：正常對照組（CON組）、甲減組（Hypo組）、甲狀腺素治療組（T4組）、多奈哌齊治療組（DON組）、甲狀腺素聯合多奈哌齊治療組（T4＋DON組），每組8只。造模總時間6周，CON組飲用正常水，其他 4組每天飲用0．05%PTU水［3］。4周后，T4組開始腹腔注射T4（溶解在生理鹽水中，6μg／100 g體重），DON組在飲用水中加0．005%DON，T4＋DON組既飲用0．005%DON也腹腔注射T4。同時，余下3組大鼠以等量生理鹽水替代注射。治療時間共2周，各組大鼠根據每周稱量的體重結果，調整給藥劑量。

1．3標本制備稱量5組大鼠體重，給予水合氯醛（0．3 ml／100 g體重）腹腔注射，麻醉后打開腹腔，腹主動脈取血待測血清T3、T4水平。取血后將大鼠取腦，冰上迅速分離背側海馬組織，左側海馬放于4%多聚甲醛溶液待做透射電鏡觀察，右側海馬置于-80℃冰箱待做Western blot實驗。

1．4甲狀腺激素水平測定采用放射免疫法進行大鼠血清T3、T4水平測定。

1．5電鏡觀察將組織切成1 mm3小塊，2．5%戊二醛4℃固定4～6 h后，再以l%鋨酸固定1 h，經乙醇脫水，環氧樹脂（Epon812）包埋，進行超薄切片，在醋酸鈾及枸櫞酸鉛溶液中浸泡染色，常規沖洗后，用日產JEM-1230型透射電鏡觀察超微結構并射片。

1.6Western blot法分析取背側海馬組織置于玻璃勻漿器，加入RIPA裂解液和PMSF，冰上勻漿，提取總蛋白。4℃、15 000 r／min離心15 min，吸取上清液。用Lorry法測定總蛋白濃度，定量后向樣品中加入2×上樣緩沖液（1∶1），98℃10 min將蛋白變性處理，分裝，-80℃凍存。各組取20μg樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2．5 h，轉膜，5%脫脂牛奶封閉過夜。次日加入一抗syt-1 （1∶1 000）及GAPDH（1∶4 000）孵育2 h，0．05% PBST溶液洗膜3次，每次10 min，洗滌后用HRP標記的IgG二抗（1∶100 000）室溫孵育1～2 h，再用0．05%PBST溶液洗膜，最后加入ECL增強發光液，在Fine-do X6顯影儀（上海天能公司）下拍攝，以GAPDH作為內參對照，計算目的蛋白與GAPDH的相對光密度比值。

1．7統計學處理運用SPSS 16．0統計軟件進行單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD法檢驗，數據以±s表示。

2　結果

2．1大鼠體重和血清甲狀腺素水平各組大鼠造模前體重差異無統計學意義；造模結束后，CON組體重增加了93．0%，而Hypo組、T4組、DON組、T4＋DON組與造模前相比體重分別增加38．6%、63．2%、35．6%、63．6%，與CON組相比差異均有統計學意義（F＝156．215，P＜0．01）。在血清放射免疫試驗中，與CON組相比，Hypo組及DON組T3、T4水平顯著減低，差異有統計學意義（F＝15．236、357．516，P＜0．01）；T4組及聯合治療組大鼠血清T3、T4水平接近正常水平，差異無統計學意義，見表1。

表1　各組大鼠體重及血清激素值比較（n＝8，±s）

表1　各組大鼠體重及血清激素值比較（n＝8，±s）

與CON組比較：**P＜0．01

組別　　體重（g）T3（nmol／L）　T4（nmol／L）造模前　　造模后CON　231．25±9．54　446．25±11．10　0．35±0．07　76．19±6．07 Hypo　233．12±7．99　323．12±18．53**0．19±0．05**21．75±2．50**T4　231．25±7．44　377．38±7．78**　0．36±0．05　75．03±4．95 DON　230．62±11．78　312．75±11．64**0．18±0．07**20．58±2．73**T4＋DON　233．75±2．31　382．38±8．48**0．37±0．10　74．50±4．81

2．2電鏡觀察

2．2．1神經元變化CON組神經元內細胞核核膜光滑完整，染色質分布均勻；線粒體發達、內部嵴結構清晰；粗面內質網及核糖體豐富（圖1A）。Hypo組神經元內細胞核染色質邊集；大量線粒體腫脹，嵴斷裂，內膜面積減少，呈現顯著空泡樣變性；粗面內質網及核糖體明顯稀疏（圖1B）。T4組、DON組神經元內細胞核核膜清晰，而細胞器較稀疏，少量線粒體內空泡形成，部分粗面內質網輕度擴張（圖1C、D）。T4＋DON組神經元內線粒體、粗面內質網及核糖體形態與CON組基本相似（圖1E）。

2．2．2突觸變化CON組突觸前膜、突觸間隙、突觸后膜3層結構清晰，特化帶明顯，突觸小泡豐富，可見清亮型和致密芯型小泡（圖2A）。Hypo組突觸前、后膜融合，突觸小泡明顯減少，幾乎不見清亮型（圖2B）。T4組、DON組突觸前、后膜模糊，突觸間隙較清晰，突觸小泡清亮型數量減少（圖2C、2D）。T4＋DON組突觸三層結構較清晰，突觸小泡較豐富，接近CON組（圖2E）。

2.3大鼠海馬syt-1蛋白表達的變化與CON組比較，syt-1蛋白在Hypo組海馬內表達顯著減少，為CON組的48．4%（P＜0．01）。在T4組和DON組，降低的syt-1蛋白表達量比Hypo組有所恢復，但與CON組比較仍有差異，分別為CON組的80．1%（P ＜0．05）、69．9%（P＜0．01）。T4＋DON組大鼠海馬內syt-1蛋白表達量為CON組的98．9%，差異無統計學意義。見圖3。

3　討論

海馬容易在成年階段受到甲減的損害，本實驗在形態學發現成年期甲減大鼠海馬內神經元及突觸超微結構出現損害。透射電鏡下神經元細胞中線粒體呈現腫脹、空泡變性，粗面內質網擴張，游離核糖體明顯稀疏。David et al［7］發現甲減大鼠神經元內的粗面內質網、高爾基復合體和線粒體形態都有改變，核糖體數目減少，與本實驗結果相符。另外，本研究還觀察到突觸出現特化帶融合，結構不清晰，突觸小泡減少的形態改變。Cortes et al［8］的研究結果表明成年甲減大鼠腦中出現多系統的神經元突觸后變化，突觸后密度減少。也有實驗報道甲減導致神經元樹突狀超微結構的退化［9］。眾所周知，線粒體和核糖體是能量和蛋白質合成的活性位點［10］，突觸作為神經元之間信息傳遞的結構基礎，上述神經元內細胞器、突觸超微結構的破壞可能會引起能量代謝的障礙，進而影響相關腦區蛋白的合成。

syt-1是一種分子量為65ku的突觸小體蛋白，其作為快速Ca2＋感受器，促進突觸小泡的融合，在神經遞質同步釋放調控過程中起著重要作用。本實驗運用Western blot方法測定的結果顯示，與對照組相比，甲減組syt-1蛋白表達量明顯減少。Wang et al［11］發現在碘缺乏和甲減大鼠的小腦中，syt-1蛋白表達下調，本研究結果與之一致，然而其受損機制仍未明確。研究［12］顯示T4可以調節腦中蛋白質的合成，T4缺乏直接導致海馬中甲狀腺素受體表達下調并影響其作用的靶蛋白的表達，甲減時syt-1蛋白表達減少可能與此有關。

T4替代治療是目前國際上公認的治療甲減的標準方案。本實驗中成年期甲減大鼠在給予常規劑量的T4治療2周后，海馬內神經元細胞器、突觸超微結構的損傷及syt-1蛋白的表達部分恢復，但未達到正常水平。研究［13］顯示，即使6周的T4替代治療也未能使表達減少的PKCγ蛋白恢復正常。上述均說明，在T4替代治療到血清甲狀腺激素恢復正常時，甲減引起的腦中分子障礙可能并沒有完全恢復。研究［14］表明，血清甲狀腺激素濃度遠遠高于其在中樞神經系統中的濃度。T4治療后海馬損傷未完全治愈的現象，可能與血清甲狀腺激素水平恢復正常時，腦內劑量仍然不足有關。研究［5］表明，當給予成年期甲減大鼠大劑量T4（20μg／100 g體重）沖擊治療時，海馬內syt-1表達可恢復到正常水平，但同時血清T3、T4水平超過正常高值，有誘發甲亢的風險。

T4聯合DON治療后，甲減大鼠海馬內神經元線粒體、粗面內質網、核糖體形態與數量基本恢復，突觸結構清晰、突觸小泡數量豐富，突觸小體內syt-1的表達量達到正常水平，說明DON能改善甲減引起的海馬損傷。DON作為膽堿酯酶抑制劑，通過與膽堿酯酶結合，阻止腦中乙酰膽堿的水解，臨床上主要用來治療輕中度認知功能障礙，具有獨立的神經保護作用。DON被報道可以改善菌素引發的神經元線粒體功能障礙［15］；維護老齡大鼠椎體神經元的樹突狀分支、增加總樹突長度和突觸后密度［16］。上述結果均提示DON可以通過改善海馬內神經元細胞器、突觸病變結構而發揮其神經保護作用。此外，有研究［17］顯示DON可以通過誘導乙酰膽堿的抗炎作用來改善tau病鼠海馬中突觸蛋白的表達；本課題組先前的免疫組織化學方法研究［3］發現，DON對甲減引起的突觸蛋白munc18、syntaxin-1的損傷有益。這些突觸蛋白的恢復可能也正是多奈哌齊發揮神經保護作用的體現。

綜上所述，成年期甲減可造成大鼠海馬內神經元細胞器、突觸超微結構的損傷及突觸小體內syt-1蛋白的表達減少，上述變化可以通過T4替代治療得到部分恢復，T4聯合DON治療使甲減導致的改變恢復至正常，比單獨應用T4治療更有效。

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Effects of thyroxine and donepezil on hippocampal ultrastructure and synaptotagm in-1 expression in hypothyroid adult rats

Zha Xiaoxue，Cai Yaojun，Wu Zhangbi，et al
（Dept of Geriatrics Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate the effectof thyroxine（T4）and donepezil（DON）treatmenton the hypothyroidism-induced alterations of ultrastructure and synaptotagmin-1（syt-1）expression in the hippocampus of adult rats．MethodsAdministration of 0．05%propylthiouracil（PTU）to drinking water for 6 weeks was used to replicate themodel of hypothyroidism．From the5th week，T4 group was given thyroxine（6μg／100 g bodyweight）by intraperitoneal injection，DON group was given 0．005%DON in the drinking water，T4＋DON group was given a combination of both，the control and hypothyroid groupswere given the same volume of saline solution by intraperitoneal injection daily．The concentration of serum T3 and T4 was determined by radioimmunoassay kits，and the hippocampal ultrastructure was observed with transmission electronmicroscope（TEM）and the protein level of syt-1 wasmeasured by Western blot．ResultsCompared to the control group，the concentration of serum T3 and T4 was significantly decreased in the hypothyroid group and the DON group（P＜0．01），but returned to the normal in the T4 group or combined with DON group．TEM revealed that signficant degeneration was in mitochondria and rarefaction in free ribosomes ofadulthpothyroid rats，synaptic structural damage and reduction ofsynaptic vesicles also appeared．The ultrastructuralwas partly restored by T4 or DON administration，but was completely restored by a combination of both treatments．Expression of syt-1 protein was significantly lower in hypothyroid rats compared with the controls（P＜0．01），and was still expressed at lower level in hypothyroid treated with T4 alone（P＜0．05），whilewas restored to normal values after co-administation of T4 and DON．ConclusionThese observations indicate that adult hypothyroidism induces ultrastructural damage and a decrease of syt-1 proten in the hippocampus，and the alterations can not be restored by T4 monotherapy．In addition，the co-administration of T4 and DON result in more effective restoration than either alone．

Key wordshypothyroidism；hippocampus；synaptotagmin-1；ultrastructure；thyroxine；donepezil

中圖分類號R 581．2；R 322．81；R 446．6-3；R 977．14

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1547-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：81272152）

作者單位：1安徽醫科大學第一附屬醫院老年內分泌科，合肥230022

作者簡介：查小雪，女，碩士研究生；