體外和體內內皮化在膠原包埋羥基磷灰石涂層的人工機械瓣膜的實驗研究

程光存，嚴中亞，李春生，嚴　宇，韋曉勇，李建華，湯丹丹，程光明，董桂福，姜　波，蔡　燕

體外和體內內皮化在膠原包埋羥基磷灰石涂層的人工機械瓣膜的實驗研究

程光存，嚴中亞，李春生，嚴宇，韋曉勇，李建華，湯丹丹，程光明，董桂福，姜波，蔡燕

摘要目的通過體外內皮化和體內內皮化，探討沉積膠原包埋羥基磷灰石（HA）涂層人工機械瓣膜的可行性及其在人工機械瓣膜支架體內的再細胞化能力。方法制備犬血管內皮細胞（VEC）懸液，接種在膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜材料上，置培養箱內分組培養如下：①37℃孵箱中靜態培養2周；②動態旋轉培養裝置中培養2周，比較兩組VEC分泌一氧化氮（NO）、前列環素（PGI2）水平；再分別將人工機械瓣膜植入犬右心房，術后6周，取出部分材料，掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察VEC在HA材料上的附著情況，了解 HA支架材料在體內的再細胞化能力。結果與靜態系統相比，人工機械瓣膜在動態旋轉系統構建膠原包埋HA涂層VEC分泌NO、PGI2水平顯著升高（P＜0．05）；在犬右心房人工機械瓣膜取出材料中，動態旋轉系統構建膠原包埋HA涂層VEC層均勻分布，并有心臟內皮細胞附著，而靜態培養系統中VEC層分布不均勻，膠原包埋HA涂層有心臟血管內皮細胞附著，而單純人工機械瓣薄膜表面出現較多的血栓形成。結論動態旋轉系統中構建的組織工程化瓣膜模型中，VEC可能成為組織工程化機械瓣膜材料；膠原包埋的HA涂層人工機械瓣膜有利于VEC的黏附和生長。

關鍵詞羥基磷灰石薄膜；犬血管內皮細胞；細胞培養；組織工程

2015-06-18接收

嚴中亞，男，教授，主任醫師，責任作者，E-mail：yan20047 ＠163．com

目前，臨床上廣泛應用熱解碳制成的人工心臟機械瓣膜，具有經久耐用的優點，但易出現表面凝血，患者往往需要終生抗凝治療［1］。脈沖激光沉積（pulsed laser deposition，PLD）技術廣泛地應用于制備各種功能薄膜、梯度膜等，近年來，為提高人工移植物表面的生物相容性，采用各種類金剛石薄膜材料在臨床上應用［2］。該研究采用PLD技術制備類金剛石膜，通過體外培養犬血管內皮細胞（vascular endothelial cell，VEC），種植在膠原復合羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）的人工機械瓣膜上，觀察它們的生物相容性，并將此種涂有膠原復合HA薄膜的人工機械瓣膜植入犬右心房內，模擬體內實際情況，6周后，觀察機械瓣膜上的HA涂層組織吸收代謝和再生情況。

1　材料與方法

1．1實驗材料30只健康8月齡成年雄性 beagle犬，12～16 kg，購自安徽省實驗動物中心。在安徽省實驗動物中心清潔級環境中飼養，動物處置符合安徽省動物實驗倫理學要求。膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜材料是由合肥大學和中科院安徽光學精密機械研究所聯合研究的新型合成的瓣膜材料，應用PLD技術在人工心臟機械瓣膜上沉積膠原包埋HA涂層，環氧乙烷消毒，將材料制備成5 mm×5 mm×1 mm和10 mm×5 mm×1 mm大小結構［3］。細胞培養用RPMI-1640培養基、DMEM培養基、新生胎牛血清（美國Gibco公司）；Ⅱ型膠原酶、苯酚、0．25%胰蛋白酶、M199培養液（美國Sigma公司）；血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（美國Santa Cruz公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）放射免疫試劑盒、前列環素（prostacyclin，PGI2）購自南京建成生物科技有限公司；實驗用滅菌生理鹽水自制；余試劑為分析純等。

1．2試驗主要儀器CO2培養箱（美國Thermo公司）；BHC-1300型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設備有限公司）；熒光倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；高速低溫冷凍離心機（德國Heraeus公司）。

1．3方法

1．3．1體外內皮化進行犬VEC的分離培養對實驗犬編號，用3%戊巴比妥30 mg／kg緩慢血管內麻醉后，側臥位固定于手術臺上，前肢懸吊，取前肢隱靜脈長約10 cm，M199培養液沖洗血管3次，至無血液殘留；1 g／LⅡ型膠原酶注入隱靜脈使其充盈，結扎兩端，放入培養皿中，37℃恒溫水浴30 min，輕揉血管，收集消化液，M199培養液反復沖洗靜脈腔，收集灌洗液于離心管中，離心后棄上清液，加入1．5 m l M199完全培養液（內含體積分數25μg／L VEGF和15%胎牛血清），重懸沉淀細胞，置細胞培養瓶中，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。5～7 d后可傳代，實驗取2～4代處于對數生長期的細胞。

1．3．2體內內皮化進行細胞種植處于對數生長期2～4代的犬VEC，2．5 g／L胰酶消化后，濃度為4 ×106／L的VEC細胞懸液。將膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜在無菌條件下置入96孔板中，接種25 μl VEC細胞懸液（細胞數1×106個），37℃、5% CO2的培養箱內靜置2～3 h，吸棄未貼壁細胞。加入1 ml含10%胎牛血清DMEM培養液，置培養箱，每天換液1次。實驗分組如下：①膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜37℃孵箱中靜態培養2周；②膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜動態旋轉培養裝置（通過微型馬達驅動，使旋轉部件上的管形支架繞中軸作緩慢旋轉，轉速60°／min）中培養2周。

1．3．3放射免疫法檢測兩組NO、PGI2濃度分別于培養3、5、7、11 d收集兩組（靜態和動態旋轉系統）VEC細胞的培養上清液，按試劑盒說明書，采用放射免疫法檢測上清液中NO、6-酮-PGF1α（作PGI2的含量）含量。

1．3．4掃描電鏡觀察分別上述兩組培養有VEC細胞的人工機械瓣膜植入犬右心房，每組犬15只，術后6周，取出部分材料，磷酸鹽緩沖液清洗瓣膜表面可能的污物，2．5%戊二醛固定，梯度（50%、70%、80%、90%、100%）乙醇溶液脫水，臨界點干燥、噴金，Philips525M型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察 VEC在HA材料上的附著情況，了解體內的VEC在HA材料上的附著、形態和界面情況。

1．4統計學處理使用SPSS 17．0軟件進行分析，其中計量資料用±s表示，采用重復測量設計的方差分析，組間資料分析采用t檢驗。

2　結果

2.1犬 VEC的觀察傳代的 VEC與鼠抗人FⅧAg多克隆抗體標記陽性，倒置熒光顯微鏡下，細胞呈梭形，生長狀況良好，核卵圓形，位于細胞中央，可判定細胞為VEC。倒置顯微鏡下，可見犬VEC在膠原包埋HA涂層人工機械瓣材料上呈圓形，單個或成小團存在，核圓形或卵圓形，見圖1。

2.2NO、PGI2測定采用放射免疫法檢測在靜態和動態旋轉系統中，膠原包埋HA涂層的人工機械瓣膜犬VEC分泌NO和PGI2含量。先采用重復測量設計的方差分析，動態旋轉系統與靜態培養條件NO、PGI2相比，檢驗統計量F值分別為6．87、7．12。與靜態培養條件相比，動態旋轉系統NO、PGI2升高明顯，差異有統計學意義（P＜0．05）。表明動態旋轉系統與體內環境更為接近，具有與正常VEC類似的“生理功能”。見表1。

表1　犬VEC在靜態和動態旋轉系統中產生NO、PGI2（n＝15）

2．3形態學觀察6周后，取出犬右心房，可見在特制動態旋轉培養裝置下，膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜形成完整VEC層，內皮細胞均勻分布（圖2A）；在靜態培養系統中，形成內皮細胞層結構不完整，HA材料上細胞分布不均勻（圖2B）；單純人工機械瓣薄膜表面有血栓形成現象（圖2C）。

3　討論

由于風濕性心臟病或感染性心內膜炎等病變累及心臟瓣膜，常常引起患者的二尖瓣、主動脈瓣狹窄或關閉不全，患者往往需要采用人工合成材料制成的機械瓣來替換病變心臟瓣膜即心臟瓣膜置換術。在心臟瓣膜置換術中，當血液與機械瓣膜接觸時常激活血小板，導致血栓形成，患者換瓣術后往往需要終生服用抗凝藥，以防血栓形成［4］；且抗凝不當易造成出血或栓塞，患者生活質量嚴重受損［5］。因此，臨床上獲取理想的人工機械瓣膜，解除心臟瓣膜置換術后終生服用抗凝藥物的痛苦非常關鍵。

本研究在合肥工業大學和中科院協助下，利用PLD技術，將膠原包埋HA涂層沉積在人工心臟機械瓣膜上，通過體外內皮化和體內內皮化研究膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜與VEC相容性，構建組織工程化機械瓣膜材料，以期獲得理想的膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜，解除人工機械瓣膜置換患者術后需終生服用抗凝藥物的痛苦。膠原包埋HA涂層為一種新型的仿生復合材料，先制備納米徑粒HA，然后制備膠原，應用PLD技術將其沉積在人工心臟機械瓣膜上，該材料主要成分是羥基磷灰石和膠原纖維，同人體骨組織結構與成分相似［6］，其多孔隙間相通的特殊結構為VEC生長提供良好的基質，為細胞和支架材料之間提供最大面積的貼附，有利于VEC成長，且生物相容性好，無排斥反應，為瓣膜外科手術提供了一種優質的全新植入材料。

本研究先進行體外內皮化，即通過體外培養VEC，種植在膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜上，觀察機械瓣膜上的HA涂層被組織吸收和瓣膜層的再生情況。研究表明，該種處理的心臟瓣膜具有無免疫原性、無需抗凝、可以生長和耐久性好等優點，是一種新型的較為理想的組織工程心臟瓣膜，可能為進一步應用于臨床的組織工程心臟瓣膜奠定基礎［7-8］。同時，本研究又進行了體內內皮化研究，將膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜植入實驗犬的右心房中，模擬心臟內部的微環境，6周后顯示，心臟VEC附著在HA薄膜表面，表明該項研究可能的光明前景。傳統靜態培養VEC方法再移植入機體可能存在一定的缺陷，而動態培養體系模擬微重力環境，培養物處于懸浮狀態［9-10］。本實驗采用自制的動態旋轉培養裝置，VEC始終受到變動切應力作用，實驗表明其促進了VEC在膠原包埋HA人工機械瓣膜上的黏附，形成均勻的組織。VEC可分泌多種血管活性物質，在動態旋轉系統中VEC分泌NO、PGI2明顯高于靜態條件，NO、PGI2可調節血管的通透性，以及凝血-纖溶平衡系統，可抑制血小板聚集，拮抗血栓烷A2生成［11］，故動態旋轉系統表現較靜態系統抗凝作用增強，抑制血栓形成。故在動態旋轉系統中接種于膠原包埋HA涂層人工機械瓣膜表面VEC，不僅貼附生長強，參與機體的代謝，形成具有“生理功能”的組織工程化瓣膜，是保持組織工程化血管流暢和防止血栓形成的重要因素。本研究將材料科學和生命科學結合起來，可能具有一定的社會意義和經濟價值，值得進一步深入研究。

（致謝：感謝合肥工業大學理學院羅樂教授，中科院安徽光學精密機械研究所方曉東、陶汝華研究員在實驗中的指導和材料合成）

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Experimental study of in vitro or in vivo endothelializaion in collagen
em bedding hydroxyapatite film coated artificialmechanical valve

Cheng Guangcun，Yan Zhongya，Li Chunsheng，et al
（Dept of Cardiac Surgery，Anhui Provincial Hospital，Hefei230001）

AbstractObjectiveThrough endothelialization in vitro and in vivo，to explore the feasibility of the collagen deposit to embed hydroxyapatite（HA）coating of artificialmechanical valve and the ability of recellularization in artificialmechanical valve scaffolds．MethodsTo prepare canine vascular endothelial cells（VECs）suspension，seed in collagen embedding HA coating artificialmechanical valvematerial．The VECswere cultured in grouping as follows：①37℃ static training in the incubator②dynamic rotation cultivation device．After two weeks，to compare the secretion levels of nitric oxide（NO），prostacyclin（PGI2）in VECs of the two groups．And then，the artificial mechanical valves were implanted in right atrium of dogs respectively．After six weeks of surgery，some materials were taken out from dogs right atrium to scan by electronmicroscope and observe the adhesion situation of VECs on HA material and explore the recellularization ability of HA scaffold material in vivo．ResultsCompared with the static culture system，the secretion levels of NO and PGI2of building collagen embedding HA coating VEC ofartificialmechanical valve in dynamic rotation system were significantly elevated（P＜0．05）．In the materials taken from dog right atrialmechanical valve，collagen embedding HA coating VEC layer was distributed evenly and had cardiac endothelial cells adhesion in the dynamic rotation cuture system．The distribution of VECs layerwas uneven in static culture system．There was collagen embedding HA coatingwith heart endothelial cells adhesion too．There were some thrombosis on pure artificialmechanical valve film surface．ConclusionTo construct tissue-engineered heart valvesmodel in dynamic rotation culture system，VECsmight become a tissue-engineered mechanical valve materials．HA coating of artificial mechanical valve embeded by collagen is advantageous to the adhesion and growth of VECs．

Key wordshydroxyapatite film；vascular endothelial cells of dog；cell culture；tissue engineering

中圖分類號R 318．2

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1556-04

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：1308085MH143）

作者單位：安徽醫科大學附屬省立醫院胸心外科，安徽省心血管病研究所，合肥230001

作者簡介：程光存，男，副主任醫師；