血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶誘導Th2免疫偏移的研究

胡媛媛，徐元宏，沈繼龍，陳　鶴

血吸蟲果糖二磷酸醛縮酶誘導Th2免疫偏移的研究

胡媛媛1，徐元宏1，沈繼龍2，陳鶴2

摘要目的分析日本血吸蟲感染以及蟲源性糖蛋白果糖二磷酸醛縮酶（SjFBPA）刺激后小鼠脾臟細胞中白介素4 （IL-4）、白細胞分化抗原CD8a因子表達量的動態變化，并探討SjFBPA與輔助型T細胞（Th2）免疫應答的關系。方法血吸蟲尾蚴感染C57小鼠10只，設正常對照組。感染8周后處死小鼠，取脾臟制備淋巴細胞懸液；用藻紅蛋白（PE）標記CD8a抗體，藻青蛋白（APC）標記IL-4抗體進行細胞染色；流式細胞儀檢測細胞因子表達量的變化。10只正常C57小鼠處死后取脾臟制成淋巴細胞懸液，加SjFBPA蛋白體外刺激，按上述流程刺激方法檢測細胞。結果小鼠感染血吸蟲8周后脾細胞中IL-4、CD8a的表達量分別為（22．39± 5．93）%、（11．34±2．15）%，正常對照組脾細胞中IL-4、CD8a的表達量分別為（1．39±0．52）%、（1．98±0．84）%，差異有統計學意義（P＜0．01）。SjFBPA體外刺激小鼠脾細胞的IL-4、CD8a的表達量分別為（14．14±1．16）%、（8．99± 0．81）%，正常對照組脾細胞中IL-4、CD8a的表達量分別為（1．86±0．93）%、（1．69±0．56）%，差異有統計學意義（P＜0．01）。結論SjFBPA在血吸蟲感染中具有誘導Th2免疫偏移的作用，樹突狀細胞作為提呈細胞參與該免疫反應。

關鍵詞日本血吸蟲；蟲源性糖蛋白果糖二磷酸醛縮酶；Th2型免疫應答

2015-07-31接收

2安徽人畜共患病研究所，合肥230032

徐元宏，男，教授，主任技師，博士生導師，E-mail：xyhong1964＠163．com

血吸蟲病是一種由蟲卵肉芽腫引起的慢性免疫性疾病，嚴重危害人類健康，全球大約有2億人感染血吸蟲，其中1．2億人有典型癥狀［1］。其病理基礎是沉積于組織中成熟蟲卵內毛蚴分泌的可溶性蟲卵抗原（soluble eggs antigen，SEA），誘發宿主發生免疫應答后形成蟲卵肉芽腫。血吸蟲感染早期以1型輔助T細胞（T helper cells，Th1）反應為主；血吸蟲尾蚴感染6周時雌蟲開始產卵，宿主出現以Th2型細胞反應為主的優勢應答，體內Th2型細胞因子分泌增多。第8～9周后，Th2應答達到高峰，此后Th1 和Th2型細胞因子分泌水平均有所下降；第12周后蟲卵內毛蚴死亡，SEA逐漸減少至消失，肉芽腫體積減小，形成局部纖維化。發生Th1型向Th2型的免疫偏移。蟲源性糖蛋白果糖二磷酸醛縮酶（schistosome fructose bisphosphate aldolase，SjFBPA）是糖代謝中重要的糖裂解酶，參與寄生蟲能量的產生，對寄生蟲的生存和活動至關重要［2］。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是一種專職抗原提呈細胞，在激活T、B細胞的特異性免疫反應及免疫耐受中均起著重要作用［3］。成熟DC激活T細胞能力很強，主要誘導免疫應答。該研究探討 SjFBPA對 Th2免疫偏移的影響以及作用途徑。

1　材料與方法

1．1動物與蛋白日本血吸蟲感染釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所，常規方法逸出尾蚴，用于感染小鼠。20只健康C57小鼠購于安徽醫科大學實驗動物中心，6～8周齡，雄性，在清潔級環境下喂養。

1．2試劑DMEM培養基為美國Hyclone公司產品；新生及胎牛血清為杭州天杭生物科技有限公司產品；青霉素鈉及硫酸鏈霉素、FITC標記CD4抗體、APC標記IL-4抗體、PE標記的CD8a抗體均來自美國Sigma公司。

1．3方法

1．3．1血吸蟲感染小鼠將20只小鼠隨機分為兩組，每組10只，一組經腹部感染日本血吸蟲尾蚴15條，另一組作為空白對照組。于感染第8周后處死小鼠并制備脾單細胞懸液，PBS調整細胞數為5× 106個／m l。

1．3．2SjFBPA蛋白純化用實驗室保存的菌種進行搖菌擴增，觀察菌液光密度值（optical density，OD）大于0．6后加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導蛋白表達，8 h后收集菌液超聲破碎離心取上清液進行層析純化，純化后取蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠分析鑒定及凝膠定量軟件quantityone純度測量，其余蛋白放入-80℃保存備用。

1．3．3FBPA蛋白刺激取正常小鼠脫臼處死，取脾臟制備脾單細胞懸液，PBS調整細胞數為5×106個／m l。加入12孔板中，純化FBPA蛋白，每孔分別加1μg LPS＋1μg FBPA，37℃ CO2培養箱共培養24 h。

1．3．4細胞染色將處理完的脾細胞懸液經1 800 r／min離心10 min棄上清液后收集進流式管中，相同條件處理的脾臟細胞分為兩批，一批每管加入1 μl FITC標記的CD4抗體，4℃避光20 min，用500 μl Stain Buffer洗滌兩次后做打孔破膜處理：每管加100μl破膜液，4℃避光20 min，再加入APC標記IL-4抗體，Wash Buffer洗滌兩次，加入500μl Stain Buffer后等待上機測量；另一批每管分別加入1μl FITC標記的CD11c抗體、PE標記的CD8a抗體4℃避光20 min后，Wash Buffer洗滌兩次，加入500μl Stain Buffer后等待上機測量。

1．3．5流式細胞儀檢測先根椐物理參數設活細胞門，然后以CD4設定CD4＋T細胞亞群，檢測CD4＋T細胞亞群中細胞因子的表達率。再選出Lin-CD11c＋細胞，進一步分析這群 Lin-CD11c＋細胞中CD8α表達情況。每次檢測前均用熒光微球對流式細胞儀進行光路和流路質控監測，保證儀器處于正常的工作狀態。

1．4統計學處理采用SPSS 11．0統計軟件對數據進行整理和分析，組間比較采用t檢驗。

2　結果

2.1FBPA蛋白純化以及濃度測定12%SDSPAGE凝膠分析圖及quantityone對凝膠圖譜進行分析，結果顯示目的蛋白相對含量為92%。見圖1。

2.2FBPA蛋白刺激小鼠脾臟細胞懸液后IL-4的表達量與正常脾臟細胞懸液的對比正常對照組的小鼠脾臟細胞懸液中IL-4的表達量為（1．86± 0．93）%，而FBPA刺激后的小鼠脾臟細胞懸液中IL-4的表達量為（14．14±1．16）%，FBPA刺激后的細胞因子IL-4表達量明顯增多（t＝38．165，P＜0．01），提示出現Th2免疫偏移特征。見圖2。

2.3血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細胞懸液的IL-4的表達量與正常脾臟細胞懸液的對比正常脾臟細胞懸液的IL-4的表達量為（1．39±0．52）%，血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細胞懸液中IL-4的表達量為（22．39±5．93）%。血吸蟲感染后8周的IL-4表達量明顯變化（t＝8．878，P＜0．01），提示已經呈Th2免疫偏移。見圖3。

2.4不同處理組小鼠脾臟細胞懸液中IL-4的含量百分比的對比正常脾臟細胞懸液的IL-4含量百分比較低，而血吸蟲感染8周后以及用FBPA刺激后的小鼠脾臟細胞懸液中IL-4含量百分比明顯升高，并且血吸蟲感染8周比FBPA單一蛋白刺激的效果更為明顯。見圖4。

2.5FBPA蛋白刺激小鼠脾臟細胞懸液后CD8a的表達量與正常脾臟細胞懸液的對比正常脾臟細胞懸液的CD8a的表達量為（1．69±0．56）%，FBPA蛋白刺激小鼠脾臟細胞懸液后的CD8a的表達量為（8．99±0．81）%。FBPA蛋白刺激的細胞因子CD8a表達量明顯變化（t＝15．695，P＜0．01），提示參與提呈作用的DC細胞活化增多。見圖5。

2.6血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細胞懸液的CD8a的表達量與正常脾臟細胞懸液的對比正常脾臟細胞懸液的CD8a的表達量為（1．98± 0．84）%，血吸蟲感染8周后小鼠脾臟細胞懸液的CD8a的表達量為（11．34±2．15）%。血吸蟲感染后8周的細胞因子CD8a表達量明顯變化（t＝10．511，P＜0．01），提示參與提呈作用的DC細胞活化增多。見圖6。

2.7不同處理組小鼠脾臟細胞懸液中CD8a＋的含量百分比的對比正常對照組脾臟細胞懸液的CD8a＋含量百分比較低，而血吸蟲感染8周后以及用FBPA刺激后的小鼠脾臟細胞懸液中CD8a＋含量百分比明顯升高，由于血吸蟲感染是綜合作用，相比FBPA單一蛋白刺激的效果更為明顯。見圖7。

3　討論

蠕蟲感染誘導的宿主Th2免疫偏移已成為感染免疫調節研究的重要模型。研究［4-6］顯示，血吸蟲對Th1介導的自身免疫性疾病和Th2介導的過敏癥均有抑制作用，有研究［7］表明Th2優勢應答出現在雌蟲產卵后，因此有研究者認為，蟲卵是誘導Th2應答的主要成分。但是，曼氏血吸蟲感染4周（尚未產卵）即出現Th2應答，單性尾蚴感染也可激發Th2優勢應答［8］。提示單個蟲體表膜和分泌排泄抗原（ESA）中的糖脂以及糖蛋白可能是促進Th2免疫偏移的主要誘導分子。成熟DC激活T細胞能力很強，主要誘導免疫應答，而不成熟DC可誘導免疫耐受。近年來又提出了DC1和DC2的亞類分類的概念，認為DC1為髓系來源的DC，表達髓系標志，主要誘導Th1型應答；DC2為淋巴系來源的DC，表達淋巴系的表面標志如CD8分子（CD8a），具有誘導Th2型應答，參與免疫調節和免疫耐受的功能，在小鼠實驗中表達淋巴系表面分子CD8α的DC細胞被認為是 DC2。本實驗中SjFBPA體外刺激小鼠脾臟細胞后引起的IL-4含量的變化顯示出Th2免疫應答的特點，和血吸蟲感染小鼠后8周脾臟細胞因子的變化特點相同，同時血吸蟲感染小鼠8周后的DC細胞中表達CD8a＋的細胞數也有一定的增加，FBPA蛋白刺激后的小鼠脾臟細胞中的DC細胞中表達CD8a＋的細胞數也呈相同幅度的增加。

綜上所述，SjFBPA通過DC細胞介導在血吸蟲感染后誘導的Th2免疫偏移中起到重要作用，對揭示蟲體免疫逃避、宿主免疫耐受、免疫偏移、免疫病理以及疫苗“失能”的分子機制有重要的指導意義。

參考文獻

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A novel research of Th2 imm une deviation induced by SjFBPA

Hu Yuanyuan1，Xu Yuanhong1，Shen Jilong2，etal
（1Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022；2Anhui Institute of Human and Animal Diseases，Hefei230032）

AbstractOb jectiveTo analyze the dynamics of IL-4，CD8a in spleen cells of mice infected with cercariae of Schistosoma japonicum or SjFBPA and investigate the relationship between SjFBPA and the Th2-dominant response．Methods10 mice were infected by cercariae and 10 mice were uninfected．8 weeks after infection，allmice were sacrificed．Spleen single cell suspension was prepared and analyzed by flowed cytometry．Analysis was performed on the IL-4，CD8a cells of spleen cells stained with anti FITC-CD4，PE-CD8a，APC-IL-4 monoclonal antibody．Resu ltsAt 8 weeks，the percentage of IL-4 and CD8a cells in infected with cercariae of Schistosoma japonicum mice was 24．5%and 7．65%，respectively，while the percentage of IL-4 and CD8a cells in uninfected mice was1．18% and 0．571%，indicating a gradual decline（P＜0．05）．The percentage of IL-4 and CD8a cells in infected with SjFBPA was 18．3%and 5．82%，the percentage of IL-4 and CD8a cells in uninfected mice was 0．91%and 0．086%，indicating a gradual decline（P＜0．05）．ConclusionThis study suggests that SjFBPA may have a potential value for the Th2 response．DC cells as presenting cells are involved in the immune response．

Key wordsSchistosoma japonicum；SjFBPA；Th2 response

中圖分類號R 383．24

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1566-04

基金項目：國家自然科學基金（編號：81171606）

作者單位：1安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科，合肥230022

作者簡介：胡媛媛，女，碩士研究生；