m iRNA-4465過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲的影響及其機制

駱廣濤，王本忠

m iRNA-4465過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲的影響及其機制

駱廣濤，王本忠

摘要目的探討miRNA-4465的過表達對乳腺癌MDAMB-231細胞遷移侵襲能力的影響及機制。方法將miRNA-4465的模擬物（minics）轉染入MDA-MB-231細胞，通過實時定量PCR檢測miRNA-4465的表達變化；運用Transwell實驗檢測轉染后細胞遷移和侵襲能力的改變。采用生物信息學技術預測miRNA-4465的潛在靶基因，并通過熒光報告載體實驗及Western blot加以證實。結果與陰性對照組相比，轉染miRNA-4465 minics組miRNA-4465表達水平明顯升高（P＝0．001）。Transwell遷移實驗結果顯示轉染miRNA-4465 minics組細胞遷移能力減弱（P＝0．001）；Transwell侵襲實驗結果顯示轉染miRNA-4465 minics組細胞侵襲能力降低（P＝0．010）。通過生物信息學技術預測了EZH2為miRNA-4465的潛在靶基因；熒光報告載體實驗結果顯示轉染miRNA-4465 minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）后熒光素酶活性較轉染陰性對照序列（NC）＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）降低66%（P＝0．001）。此外將miRNA-4465轉染入MDA-MB-231細胞后EZH2蛋白表達降低。結論miRNA-4465能降低MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力，這個過程可能是通過調控EZH2基因的表達實現的。

關鍵詞miRNA-4465；EZH2；乳腺腫瘤；轉移

2015-07-31接收

王本忠，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：wangbenzhong2459＠126．com

乳腺癌發生遠處轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因，因此研究乳腺癌轉移的相關機制對于提高轉移乳腺癌患者生存率和改善患者生活質量具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）已經證實能潛在促進或抑制乳腺癌轉移［1］。近年來研究［2-4］表明，miRNA-26家族與多種腫瘤轉移侵襲有關，如肺癌、肝癌及膀胱癌等。miRNA-26家族由miRNA-26a、miRNA-26b、miRNA-1297和miRNA-4465等 4個種子區序列相同（UCAAGUA）的miRNA組成。目前對于miRNA-26家族參與腫瘤轉移侵襲的研究主要集中在miRNA-26a、miRNA-26b、miRNA-1297，而miRNA-4465在乳腺癌轉移侵襲過程中的作用研究甚少。該研究擬通過將miRNA-4465 minics轉染入具有高侵襲性的乳腺癌MDA-MB-231細胞，檢測miRNA-4465對MDA-MB-231細胞遷移侵襲能力的影響，探討其作用的分子機制。

1　材料與方法

1．1材料乳腺癌MDA-MB-231細胞由中國科學技術大學生命科學學院朱濤教授惠贈，細胞來源于美國模式培養物集存庫；牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清、DMEM培養基及Opti-MEM培養基購自Gibco公司；Transwell小室購自Corning公司；Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司；miRNA-4465 mimics購自銳博公司；Matrigel膠購自BD公司；EZH2抗體購自Cell Signaling Tech公司，GAPDH抗體購自Abcam公司；質粒psiCHECK2及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；限制性內切酶Xho I、Not I及逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；DNA連接試劑盒及實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；DNA小抽及中抽試劑盒購自Axygen公司。

1．2方法

1．2．1細胞培養用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養 MDA-MB-231細胞，置于 5%CO2、37℃細胞培養箱中常規培養，根據細胞狀態每隔2～3 d換新鮮培養基一次。

1．2．2實驗分組根據轉染情況將實驗分為陰性對照組（NC組）及 miRNA-4465 minics轉染組。轉染試劑選用Lipofectamine 2000，轉染步驟參考Lipofectamine 2000轉染試劑說明書。

1．2．3實時定量PCR運用實時定量PCR檢測轉染miRNA-4465 minics至MDA-MB-231細胞后miRNA-4465的相對表達量。miRNA-4465 minics序列：5′-CUCAAGUAGUCUGACCAGGGGA-3′。首先 TRIzol法抽提細胞總RNA，再使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄合成cDNA。反應條件為42℃60min，70℃10 min。以逆轉錄得到的cDNA產物為模板，使用實時定量PCR檢測miRNA-4465的相對表達量，每個樣品設置2個復孔。內參照為U6。HsamiRNA-4465引物序列F：5′-CUCAAGUAGUCUGAC-3′，R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。實時定量PCR反應條件如下：95℃預變性40 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環，溶解曲線條件：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。根據反應結束后的Ct值（Ct值為反應中每個反應管內的實時熒光信號達到設定的閾值所對應的擴增循環數），通過2-ΔΔCt法計算樣品中miRNA-4465的相對表達量。

1．2．4細胞遷移和侵襲實驗在進行侵襲實驗時，首先用50 mg／LMatrigel1∶8稀釋包被Transwell小室底部膜的上室面。消化細胞后離心棄去培養液，用含有牛血清白蛋白的無血清培養基重懸，調整細胞密度至4×108個／L。下室加入600μl含有10%胎牛血清的完全培養基，24～48 h后棄去下室培養基，90%乙醇溶液室溫固定30 min。晾干后使用0．1%結晶紫溶液室溫染色10 min。用棉簽擦去上室的細胞，檢測下室的細胞數目并隨機取5個視野拍照。遷移實驗不需要鋪Matrigel膠，其余實驗步驟與侵襲實驗一致。

1．2．5miRNA-4465靶標基因預測由于miRNA與其潛在靶基因的結合具有一定的規律性，可以通過生物信息學技術進行編程從而預測miRNA的潛在靶標基因。通過在線miRNA靶基因預測工具TargetScan、PicTar和miRanda 3個數據庫共同預測miRNA-4465的潛在靶點。

1．2．6熒光報告載體實驗從NCBI中下載人EZH2基因序列，采用Primer5．0軟件設計引物，并使用PCR法擴增EZH2 3’UTR。將EZH2 3’UTR序列插入到psiCHECK2質粒中，并將miRNA-4465相應識別位點突變后插入到psiCHECK2質粒中構建突變型質粒。EZH2 3’UTR（野生型）引物序列F：5′-TATATTCTCGAGCATCTGCTACCTCCTCCCC-3′，R：5′-TATATGCGGCCGCCAAGTTCAAGTATTCTTAT-3′；Mut-EZH2 3’UTR（突變型）引物序列F：5′-CTTTTTATTGCCTTCTCAGGTCCTGCAAAGTGTTTG-3′，R：5′-CAAAACACTTTGCAGGACCTGAGAAGGCAATAAAAAG-3′。PCR反應條件為：98℃5 s，98℃10 s，50℃5 s，72℃1 min，32個循環后72℃延伸2 min。分離PCR擴增的產物并純化。Xho I 和Not I雙酶切PCR產物及psiCHECK2質粒，轉化篩選陽性克隆，挑克隆后接種于4 ml含氨芐青霉素抗性的LB培養液中，37℃恒溫搖床培養10 h，小抽提取質粒后測序。擴增克隆并提純質粒。將MDAMB-231細胞傳至T25培養瓶中，待其細胞生長至30%～40%密度時將細胞消化，重懸并計數，將細胞濃度調節至5×105／ml，向24孔板中每孔加入20μl細胞懸液（即1萬個細胞），用Lipofectamine 2000進行組合轉染。實驗分組如下：野生型組：轉染入陰性對照序列＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）和miRNA-4465minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）；突變型組：轉染入陰性對照序列＋psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）和miRNA-4465 minics＋psiCHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）。轉染24 h后收集細胞，加入100μl的細胞裂解液（Lysis Buffer），置于搖床避光孵育15 min。吸取細胞裂解混合液，10 000 r／min離心10 min，將上清液轉移至新的離心管中。在熒光素酶報告基因檢測儀上檢測螢火蟲熒光素酶的活性值。樣品熒光素酶活性＝（海腎熒光素酶活性值-本底值）／（螢火蟲熒光素酶活性值-本底值）。每組實驗重復3次。

1．2．7Western blot法轉染后待細胞長滿6孔板，使用預冷的PBS清洗細胞2次。將PBS棄去，并迅速加入細胞裂解液進行裂解。收取蛋白后采用標準曲線法檢測蛋白濃度，然后加入5×上樣緩沖液在100℃沸水浴中煮沸10 min。等量蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后使用PVDF膜進行轉膜，轉膜條件為300 mA恒流60～90 min。轉膜后使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，一抗4℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h。使用化學發光儀進行顯影。以GAPDH作為內參蛋白。

1．3統計學處理采用SPSS 16．0及Excel軟件分析數據，計量資料結果用±s表示。兩組均數比較采用t檢驗。

2　結果

2.1MDA-MB-231細胞轉染m iRNA-4465 m inics后m iRNA-4465表達的改變miRNA-4465在NC組和miRNA-4465 minics轉染組的相對表達量分別為0．99±0．10、38．69±1．70。與NC組相比，miR-NA-4465 minics轉染組miRNA-4465表達水平明顯升高，差異有統計學意義（t＝39．275，P＝0．001）。

2.2MDA-MB-231細胞轉染m iRNA-4465 m inics后遷移和侵襲能力的改變

2．2．1對細胞遷移能力的影響Transwell遷移實驗結果顯示NC組和miRNA-4465 minics轉染組細胞計數分別為156．67±9．29、85．67±6．03，差異有統計學意義（t＝34．715，P＝0．001），見圖1。Transwell遷移實驗結果表明轉染miRNA-4465后MDAMB-231細胞遷移能力降低。

2．2．2對細胞侵襲能力的影響結果顯示NC組和miRNA-4465 minics轉染組侵襲細胞計數分別為159．67±18．18、93．00±11．00，差異有統計學意義（t＝10．151，P＝0．010），見圖2。Transwell侵襲實驗實驗結果表明轉染miRNA-4465后MDA-MB-231細胞侵襲能力降低。

2.3生物信息學技術預測 EZH2為 m iRNA-4465的靶標基因通過生物信息學技術預測了EZH2可能為miRNA-4465的潛在靶基因。圖3中為TargetScan軟件測出EZH2 3’UTR第250～257位（即斜體字部分）為miRNA-4465結合靶點。

2.4熒光報告載體實驗證實m iRNA-4465與EZH2基因的靶向關系結果顯示轉染入psi-CHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）＋miRNA-4465 minics后熒光素酶活性較轉染陰性對照序列（NC）＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）降低66．0%，差異有統計學意義（P＝0．001）；而轉染入psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）＋miRNA-4465 minics后熒光素酶活性較陰性對照序列（NC）＋psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）變化不大（下調3．0%，P＝0．767），見圖4。熒光報告載體實驗證實miRNA-4465可以與EZH2 3’UTR結合，表明EZH2是miRNA-4465的直接作用靶點。

2.5MDA-MB-231細胞轉染m iRNA-4465 m inics后EZH2蛋白的表達變化與NC組相比，將miRNA-4465 minics轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞后EZH2蛋白表達降低。見圖5。

3　討論

miRNA是一類長度約為19～23個核苷酸的內源性非編碼RNA，可以通過其種子序列與靶基因的mRNA3’非翻譯區（3’UTR）結合而抑制靶基因的轉錄和翻譯。目前已知的促進乳腺癌轉移的miRNA有miRNA-21、miRNA-22、miRNA-103、miRNA-182、miRNA-143和miRNA-520c等；而抑制乳腺癌轉移的miRNA有miRNA-20a／b、miRNA-126、miRNA-205、miRNA-15b和miRNA-200家族等［5］。miRNA-26家族成員中miRNA-26a已經證實能抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力［6］，而具有與miRNA-26a相同種子序列的miRNA-4465是否具有此功能尚不明確。本實驗將miRNA-4465 minics轉染入MDA-MB-231細胞后，成功上調了miRNA-4465的表達。隨后運用Transwell遷移和侵襲實驗檢測了轉染miRNA-4465 minics后細胞遷移和侵襲能力的改變，結果顯示MDA-MB-231細胞遷移和侵襲能力均顯著降低。TargetScan、PicTar和miRanda三種在線預測工具預測miRNA-4465潛在的靶標基因。TargetScan預測EZH2可能是miRNA-4465的靶標基因。本實驗挑選了EZH2作為下一步的研究基因是因為：①EZH2蛋白在乳腺癌等多種惡性腫瘤內高表達；②EZH2蛋白與乳腺癌的侵襲轉移密切相關［7］；③此前已經有研究［6］表明在乳腺癌細胞中miRNA-26a能調控EZH2基因的表達。miRNA-4465作為miRNA-26a同家族成員，具備相同的種子序列，也可能與EZH2 mRNA 3’UTR結合使其降解。在通過生物信息學技術預測了EZH2可能是miRNA-4465的下游靶標基因后，采用熒光報告載體實驗驗證了miRNA-4465與EZH2基因的靶向關系。人EZH2基因是果蠅zeste基因增強子的同源基因，屬于多梳蛋白復合物（PcG）基因家族成員。EZH2蛋白作為EZH2基因的轉錄產物，是表觀遺傳學中多梳阻遏蛋白PRC2的一個重要的催化亞基，它具有組蛋白甲基轉移酶的活性，能將組蛋白H3上第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3），從而沉默下游基因。

目前關于miRNA-26家族調控EZH2基因的研究主要集中在miRNA-26a中。Zhang et al［8］通過研究證實在乳腺癌組織中miRNA-26a的表達降低，而EZH2基因表達升高。通過將外源性的miRNA-26a轉染至乳腺癌MCF-7細胞后，原先高表達的EZH2表達降低。Jansen etal［9］在他莫昔芬耐藥乳腺癌細胞中也發現EZH2基因在上游受到miRNA-26a的調控。本實驗結果表明了miRNA-4465與EZH2的靶向作用關系，而EZH2已經證實能促進乳腺癌的侵襲轉移，miRNA-4465對MDA-MB-231細胞遷移侵襲能力的影響是否是通過調控EZH2基因實現的，還需要進一步研究。

根據miRNA-4465在乳腺癌轉移過程中所扮演的角色可以為未來開展乳腺癌治療提供新思路，即通過外源性導入miRNA-4465從而抑制乳腺癌的轉移。已經有研究者發現通過外源性導入miRNAs能通過增加抗瘤活性從而抑制腫瘤的侵襲轉移［10］。鑒于表觀遺傳學在乳腺癌發生發展過程中的重要作用，靶向抑制EZH2的表達也有可能成為乳腺癌治療的一個新策略。目前人們已經研發了一些高選擇性的EZH2抑制劑，如GSK126及GSK343等［11］。miRNA-4465和EZH2均有可能作為轉移性乳腺癌的治療新靶點，為未來乳腺癌的治療提供新的方向。

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中圖分類號R 737．9

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1570-05

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：11040606M180）

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院乳腺外科，合肥230022

作者簡介：駱廣濤，男，碩士研究生；