鹽酸帕羅西汀對卵巢切除大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及血清雌激素水平的影響

謝雙燕，胡佳佳，周伯榮，劉遠(yuǎn)波

鹽酸帕羅西汀對卵巢切除大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及血清雌激素水平的影響

謝雙燕*，胡佳佳*，周伯榮，劉遠(yuǎn)波

摘要目的探討抗抑郁劑鹽酸帕羅西汀對卵巢切除大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、血清雌激素水平及大鼠海馬雌激素受體表達(dá)的影響。方法采用SD雌鼠雙側(cè)卵巢切除（OVX）作為雌激素波動引起的抑郁與認(rèn)知障礙模型，用Morris水迷宮實驗來測試大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。實驗共分為正常對照組、OVX對照組、OVX藥物組。予5-羥色胺重攝取抑制劑類藥物：鹽酸帕羅西汀10 mg／（kg.d）干預(yù)4周。采用ELISA法測量SD大鼠血清黃體生成素、卵泡刺激素、雌激素。免疫組化法檢測大鼠海馬雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ）的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。結(jié)果①Morris水迷宮實驗中，OVX對照組和OVX藥物組的逃避潛伏期明顯縮短，停留在平臺時間百分比明顯增加。②OVX藥物組的血清雌激素較OVX對照組明顯增加（P＜0．05）。③藥物組與非藥物組的ERα、ERβ表達(dá)無明顯差異。結(jié)論帕羅西汀增加OVX大鼠血清雌激素水平和改善學(xué)習(xí)記憶能力，而對海馬ERα、ERβ表達(dá)無明顯影響。

關(guān)鍵詞卵巢切除；學(xué)習(xí)記憶；雌激素；雌激素受體

2015-07-25接收

周伯榮，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhoubr8＠aliyun．com

*對本文具有同等貢獻(xiàn)

抑郁和認(rèn)知障礙共同發(fā)生的現(xiàn)象或者說共病的發(fā)病率較高。Meta分析顯示老年抑郁、輕度認(rèn)知障礙及老年癡呆可能是一個臨床疾病的連續(xù)癥狀［1］。目前，關(guān)于抑郁與認(rèn)知障礙共病的具體分子機(jī)制尚不清楚，但不管是抑郁還是認(rèn)知障礙，女性的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于男性，所以雌激素作為區(qū)別于男女性別的重要激素而被關(guān)注。雌激素對情感和認(rèn)知都有一定的影響，文獻(xiàn)［2］報道雌激素水平的改變可以引起抑郁與認(rèn)知障礙，雌激素也有治療女性抑郁，改善女性認(rèn)知障礙的作用。雌激素在大腦功能實現(xiàn)的信號通路主要是通過雌激素受體（estrogen receptors，ERs）調(diào)節(jié)，經(jīng)典的ERs包括ERα和ERβ，而且大腦雌激素不僅來源于外周的雌二醇（estradiol，E2），還可以自身合成［3］。對于女性抑郁，因雌激素替代治療存在的諸多弊端，非激素治療越來越多的應(yīng)用在絕經(jīng)期癥候群，特別是5-羥色胺重攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）對于改善絕經(jīng)后抑郁有著明顯的效果，而且SSRI聯(lián)合雌激素使用時抗抑郁作用加強(qiáng)［4］。另外一方面，SSRI在抗抑郁治療中，女性的效果明顯好于男性，同時具有改善認(rèn)知功能和重塑神經(jīng)細(xì)胞的作用［5］。SSRI類藥物有性別的差異和對認(rèn)知功能改善的效果，其原因文獻(xiàn)［6］報道是雌激素對五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）系統(tǒng)有影響，但SSRI對雌激素系統(tǒng)的作用，除了對水生動物的少量研究外，在大鼠中的研究鮮有報道，所以該研究采用雙側(cè)卵巢切除（ovariectomized，OVX）SD大鼠，初步探討SSRI抗抑郁劑是否影響大鼠體內(nèi)血清雌激素水平及其受體在海馬的表達(dá)，來間接反映大腦中的雌激素水平。

1　材料與方法

1．1實驗方案應(yīng)用SD雌性大鼠雙側(cè)OVX模型作為低雌激素的女性抑郁［7］和認(rèn)知障礙模型［8］，按是否應(yīng)用SSRI類藥物（鹽酸帕羅西汀）干預(yù)進(jìn)行亞組分組，另設(shè)立成年健康假手術(shù)組作為空白對照。治療前后進(jìn)行Morris水迷宮實驗來驗證帕羅西汀對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響；ELISA方法測量大鼠血清黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌激素；免疫組化法觀察大鼠海馬ERα和ERβ的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。

1．2實驗動物模型制作和分組約3月齡成年健康SD大鼠，250～300 g，購自廣東省實驗動物中心，于廣州醫(yī)學(xué)院動物中心飼養(yǎng)。成年大鼠隨機(jī)分為雙側(cè)卵巢切除大鼠空白對照組（OVX對照組）、雙側(cè)卵巢切除大鼠帕羅西汀干預(yù)組（OVX藥物組）、正常大鼠空白對照組（正常對照組），每組8只。雙側(cè)卵巢切除術(shù)：大鼠檢疫1周通過后進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，在動物實驗室進(jìn)行。對于正常對照組大鼠，除了未切除大鼠雙側(cè)卵巢，其他操作同前。所有大鼠搬回另一動物室，喂養(yǎng)充足的水和飼料，1周后大鼠基本恢復(fù)。藥物干預(yù)：帕羅西汀的用藥劑量是10 mg／kg，實驗組每只大鼠藥物干預(yù)前稱重，每10 mg帕羅西汀用5 ml生理鹽水稀釋，蒸餾水的灌胃容積5 m l／kg，灌胃4周；正常對照組和OVA對照組用等量的生理鹽水灌胃4周，每天上午9：00～10：00灌胃。Morris水迷宮實驗：于治療前和治療結(jié)束后的第1天行學(xué)習(xí)記憶能力測定。采用Morris水迷宮（定位航行實驗和空間探索實驗）檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能。

1.3ELISA法檢測雌激素、LH、FSH水平ELISA試劑盒購自北京綠源博德生物科技有限公司，空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或標(biāo)本，其余相應(yīng)孔中加測試標(biāo)本，所有標(biāo)本集中檢測。

1.4免疫組化法檢測大鼠海馬ERα和ERβ的表達(dá)免疫組化S-P超敏試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；ERα抗體（sc-542）、ERβ抗體（sc-6821）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司）。通過取材固定和冰凍切片，生物素標(biāo)記DAB顯色等；空白對照實驗，用PBS代替一抗，其余步驟不變。最后在放大200倍照片上用I-magine J軟件采用人工計數(shù)的方法來計算ERα和ERβ的表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。

1．5統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用方差分析（ANOVA）。不符合方差齊性或非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用對數(shù)轉(zhuǎn)換，使其符合正態(tài)分布。

2　結(jié)果

2．1各組大鼠Morris水迷宮實驗數(shù)據(jù)比較各組大鼠在動物行為學(xué)觀察前的體重見表1。方差分析示3組平均體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究表明隨著訓(xùn)練時間的推移，大鼠的逃避潛伏時間明顯縮短，初始訓(xùn)練的平均時間為（17．82±7．64），結(jié)束訓(xùn)練為（11．31±4．52），表明動物的學(xué)習(xí)能力不斷的提升。方差分析顯示，OVX對照組相對于正常對照組的逃避潛伏期有明顯升高（F＝5．78，P＝0．021），而在目標(biāo)象限停留的時間百分比明顯縮短（F＝10．16，P＝0．034）；帕羅西汀使OVX大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（F＝12．39，P＝0．001）；使在目標(biāo)象限停留的時間百分比明顯提高（F＝6．39，P＝0．027）。見表1。

表1　各組　M orris水迷宮的認(rèn)知行為相關(guān)指標(biāo)之間比較

2.2ELISA法檢測血清雌激素、FSH、LH的結(jié)果與正常對照組比較，OVX對照組和OVX藥物組血清雌激素水平明顯下降（P＜0．05）；OVX藥物組較OVX對照組雌激素明顯升高（P＜0．05）；OVX藥物組與正常對照組比較，LH水平下降（P＜0．05）；OVX藥物組的血清FSH、LH水平較OVX對照組存在下降趨勢，但無明顯差異（P＝0．140、0．068）。見表2。

表2　各組血清雌激素、FSH、LH水平（±s）

表2　各組血清雌激素、FSH、LH水平（±s）

與正常對照組比較：*P＜0．05；與　OVX對照組比較：＃P＜0．05

組別　　雌激素（ng／L）　FSH（IU／L）　LH（IU／L）525．44±11．92　17．91±0．66　10．01±0．33 OVX對照　394．70±37．05*　16．95±0．65　9．42±0．47 OVX藥物　454．61±32．99*＃14．24±0．65　8．01±0．69正常對照*

2.3大鼠海馬ERα和ERβ的表達(dá)情況在放大400倍顯微鏡下，ERα和ERβ（圖1）在大鼠海馬椎體細(xì)胞層表達(dá)量都很高，統(tǒng)計分析得出各組海馬CA1區(qū)ERβ的陽性表達(dá)量明顯高于ERα。采用非參數(shù)Mann-whitney檢驗，OVX組、海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)ERα和ERβ的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)較正常對照組明顯降低（P＜0．05）；OVX兩組和組內(nèi)大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)ERα和ERβ的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3　各組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)的ERα和ERβ的陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)比較

3　討論

本研究中的OVX組較正常對照組血清雌激素明顯降低，驗證了本實驗OVX模型成功。帕羅西汀藥物治療組明顯提高 OVX組的雌激素水平。研究［9］顯示，日本青鳉飼養(yǎng)在含0．1和0．5 g／L氟西汀的水缸4周后血清中雌激素水平明顯增加，對斑馬貝的研究顯示，暴露在含20和200 ng／L氟西汀的水中6 d，在200 ng／L氟西汀的水中，該生物體內(nèi)的雌激素水平上升了1．5倍［10］。SSRIs已經(jīng)被報道影響多種細(xì)胞色素的P450酶，而這類酶又同時負(fù)責(zé)很多的內(nèi)源性和外源性的單體轉(zhuǎn)化，包括類固醇。在OVX藥物組，可能是SSRI對P450的抑制作用，從而使雌激素分解速度下降。但LH下降說明SSRI 對HPG軸同樣發(fā)揮著影響。綜合以上，SSRI對于雌激素的影響是多種因素綜合的結(jié)果，在雙側(cè)卵巢切除鼠中雌激素水平相對較低時，SSRI對雌激素水平的升高作用占主導(dǎo)。并且Morris水迷宮實驗數(shù)據(jù)顯示，帕羅西汀明顯改善OVX大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，雌激素具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，提示雌激素的提高可能是帕羅西汀改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的原因。

研究［6］已證實雌激素系統(tǒng)對5-HT系統(tǒng)的合成和降解、釋放和自抑制及突觸后膜受體都有影響。研究［11-12］顯示外周雌激素對ER在腦的表達(dá)的實驗都顯示出不同的結(jié)果。Mitchner et al［11］發(fā)現(xiàn)SD大鼠服用雌激素后下丘腦ERα和ERβmRNA的表達(dá)并沒有變化。成年大鼠服用苯甲酸E2后腦垂體的ERα和ERβmRNA顯示出時間依賴性的下降［12］。卵巢切除術(shù)后的大鼠，服用E2后ERα的表達(dá)增加，但對海馬ERβ沒有任何影響［13］。這些都表明了外周雌激素可上調(diào)或下調(diào)大腦ERα和ERβ的表達(dá)，而且這種作用依賴雌激素服用的時間、大腦的部位及實驗對象本身的狀態(tài)。5-HT系統(tǒng)對雌激素系統(tǒng)影響研究并不多，目前僅知SSRI有影響雌激素體內(nèi)降解作用，有研究［14］顯示，SSRI有雌激素受體激動劑的作用。海馬自身合成雌激素［7］，在雌激素受體ERα和ERβ表達(dá)中起著直接和重要的作用。結(jié)合本研究OVX組的雌激素受體ERα和ERβ表達(dá)較正常成年鼠明顯下降，提示ER與雌激素水平波動或下降相關(guān)，可能與抑郁或?qū)W習(xí)記憶能力障礙相關(guān)。另一方面，SSRI對外周雌激素水平存在影響，但并沒有影響海馬雌激素受體，表明SSRI對外周雌激素的影響可能不足以影響到大腦海馬雌激素或海馬自身合成雌激素的水平。

參考文獻(xiàn)

［1］Panza F，F(xiàn)risardiV，Capurso C，et al．Late-Life depression，mild cognitive impairment，and dementia：possible continuum？［J］．Am JGeriatr Psychiatry，2010，18（2）：98-116．

［2］Freeman EW，Sammel M D，Lin H，et al．Associations of hormones and menopausal status with depressed mood in women with no history of depression［J］．ArchGen Psychiatry，2006，63（4）：375-82．

［3］Kancheva R，HillM，Novak Z，et al．Neuroactive steroids in periphery and cerebrospinal fluid［J］．Neuroscience，2011，191：22 -7．

［4］Morgan M L，Cook IA，Rapkin A J，et al．Estrogen augmentation of antidepressants in perimenopausal depression：A pilot study［J］JClin Psychiatry，2005 66（6）：774-80．

［5］Keers R，Aitchison K J．Gender differences in antidepressant drug response［J］．Int Rev Psychiatry，2010，22（5）：485-500．

［6］Müller JC，Imazaki P H，Boare A C，et al．In vivo and in vitro estrogenic activity of the antidepressant fluoxetine［J］．Reprod Toxicol，2012，34（1）：80-5．

［7］Walf A A，F(xiàn)rye C A．Effects of two estradiol regimens on anxiety and depressive behaviors and trophic effects in peripheral tissues in a rodentmodel［J］．Gend Med，2009，6（1）：300-11．

［8］Feng Z，Cheng Y，Zhang JT．Long-term effects ofmelatonin or 17 beta-estradiol on improving spatial memory performance in cognitively impaired，ovariectomized adult rats［J］．Pineal Res，2004，37（3）：198-206．

［9］Foran CM，Weston J，Slattery M，et al．Reproductive assessment of Japanesemedaka（oryzias latipes）following a four week fluoxetine（SSRI）exposure．［J］Arch Environ Contam Toxicol，2004，46（4）：511-7．

［10］Lister A，Regan C，Van Zwol J，etal．Inhibition of egg production in zebra fish by fluoxetine and muni cipal effluents：amechanistic evaluation［J］．Aquat Toxicol，2009，95（4）：320-9．

［11］Mitchner N A，Garlick C，Ben-Jonathan N．Cellular distribution and gene regulation of estrogen receptor a and in the rat pituitary gland［J］．Endocrinology，1998，139（9）：3976-83．

［12］Tena-Sempere M，Gonzalez L C，Pinilla L，et al．Neonatal imprinting and regulation of estrogen receptor alpha and beta mRNA expression by estrogen in the pituitary and hypothalamus of the male rat［J］．Neuroendocrinology，2001（73）：12-25．

［13］Rodgers SP，Bohacek J，Daniel JM．Transientestradiol exposure duringmidd le age in ovariectomized rats exerts lasting effects on cognitive function and the hippocampus［J］．Endocrinology，2010，151（3）：1194-203．

［14］Yang LC，Zhang Q G，Zhou C F，etal．Extranuclear estrogen receptorsmediate the neuroprotective effects of estrogen in the rat hippocampus［J］．PLoSOne，2010，5（5）：e9851．

Effect of paroxetine on learning and memory ability and serum estrogen in rats

Xie Shuangyan，Hu Jiajia，Zhou Borong，et al
（Dept of Neurology，The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong510150）

AbstractObjectiveTo observe whether paroxetine affects rats’learning and memory ability，serum estrogen and the expression of estrogen receptors in hippocampus．MethodsThe SD ovariectomized（OVX）rats were adopted as the model of estrogen＇s fluctuation leading to depressive symptoms and cognition disorder，treated with paroxetine by intragastric administration at10 mg／（kg.d）for 4 weeks，and the sham rats as control group．Morris watermazewas used to testify the effectof paroxetine on learning andmemory ability．The levelofserum luteinizing hormone，follicle-stimulating hormone，estrogen wasmeasured by ELISA．Expressions of ERαand ERβin hippocampal neuronswere detected by immunohistochemistry．Resu lts①In Morriswatermaze experiment，compared to the control group，the escape latency of two drug-groupswere obviously shortened；the time of staying in the platform significantly increased．②Serum estrogen of drug-group was significantly increased compared with the control groups（P＜0．05）．③The ER expression between groups treated with paroxetine and the group without paroxetine in OVX rats had no difference．ConclusionParoxetine increses serum estrogen levels and improves the learning and memory ability，and has no significant effect on ER expression in hippocampal neurons．

Key wordsovariectomy；learning and memory ability；estrogen；estrogen receptor

中圖分類號R 741．05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1602-04

基金項目：廣東省科技計劃項目（編號：2011B060300027）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院項目（編號：2012Y01）

作者單位：廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州510150

作者簡介：謝雙燕，女，醫(yī)師；