人β4GalTⅡ基因在哺乳動物細(xì)胞株中的表達(dá)與定位

徐雪琴，潘林鑫，耿慧武，劉曉穎，范禮斌

Xu Xueqin，Pan Linxin，Geng Huiwu，et al（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei　230032）

人β4GalTⅡ基因在哺乳動物細(xì)胞株中的表達(dá)與定位

徐雪琴，潘林鑫，耿慧武，劉曉穎，范禮斌

摘要目的運用基因克隆技術(shù)構(gòu)建人源β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（β4GalTⅡ）真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中，觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，同時轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞中檢測其表達(dá)。方法分別設(shè)計帶FLAG標(biāo)簽和GFP標(biāo)簽的β4GalTⅡ基因的特異性引物，以含人β4GalTⅡ全長cDNA序列為模板，定向構(gòu)建到pcDNA3．1（＋）及pCDGFP真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。通過酶切和測序鑒定陽性重組質(zhì)粒，利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染COS7、HEK 293T細(xì)胞，免疫熒光顯微鏡觀察重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，Western blot法鑒定重組蛋白的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG和pCDGFP-β4GalTⅡ重組表達(dá)載體，定位實驗表明：β4GalTⅡ-FLAG和GFP-β4GalTⅡ二者在COS7細(xì)胞中均主要定位在細(xì)胞核周圍，并有明顯的塊狀染色，胞核中未見明顯分布；Western blot法檢測顯示重組β4GalTⅡ蛋白在HEK 293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論獲得了人β4GalTⅡ的真核表達(dá)質(zhì)粒，并能在COS7和HEK 293T細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究β4GalTⅡ的功能及其與其他蛋白的相互作用奠定了一定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞β4GalTⅡ；轉(zhuǎn)染；細(xì)胞定位；蛋白表達(dá)

2015-07-30接收

范禮斌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn；

劉曉穎，女，副教授，責(zé)任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn

β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（β1，4-galactosyltransferaseⅡ，β4GalTⅡ）是β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族的一員，Raquel利用EST數(shù)據(jù)庫獨立發(fā)現(xiàn)的，其與家族中首個被發(fā)現(xiàn)的β4GalTⅠ有高達(dá)55%的序列同源性，在胎腦中表達(dá)較高，在心臟、骨骼肌、胰腺、睪丸、前列腺、卵巢、小腸中也均有表達(dá)［1-3］。人β4GalTⅡ基因定位于1p34-p33，包含10個外顯子，基因全長111 970 bp，mRNA全長2 209 bp，編碼含372個氨基酸殘基的約42 ku的β4GalTⅡ蛋白［1，4］。β4GalTⅡ與大多數(shù)的糖基轉(zhuǎn)移酶有著相似的結(jié)構(gòu)域，主要包括短的胞質(zhì)區(qū)N-末端肽段、跨膜結(jié)構(gòu)域以及催化結(jié)構(gòu)域，其跨膜結(jié)構(gòu)域可能對其在高爾基復(fù)合體上的定位是至關(guān)重要的［5］。該研究通過在pcDNA3．1（＋）載體及pCDGFP載體的多克隆位點插入β4GalTⅡ的cDNA片段，分別構(gòu)建了帶FLAG標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG和帶GFP標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDGFP-β4GalTⅡ，并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)COS7和HEK 293T細(xì)胞中，初步觀察β4GalTⅡ在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的定位及表達(dá)情況，為后續(xù)探究該蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞含人β4GalTⅡ全長cDNA序列的模板由安徽醫(yī)科大學(xué)李俊教授提供；質(zhì)粒pcDNA3．1（＋）購自Invitrogen公司；pCDGFP質(zhì)粒、TG1菌株、COS7及HEK 293T細(xì)胞株均由安徽醫(yī)科大學(xué)生物實驗室保存。

1．2主要試劑PCR引物合成和測序均由上海英濰捷基生物工程有限公司完成；PrimerSTAR?HS DNA Polymerase購自TaKaRa公司；EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、小牛腸堿性磷酸酶、T4 DNA連接酶及Lambda DNA Marker購自Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自Axygen公司；蛋白Marker購自BioRad公司；DMEM完全培養(yǎng)基、胎牛血清分別購自Hyclone公司和Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Opti-MEM購自Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液和一抗稀釋液購自上海碧云天公司；Flag一抗購自Sigma公司；GFP一抗購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG與羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司；熒光封片膠購自Dako公司；顯色試劑盒購自Pierce公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或符合實驗要求。

1．3方法

1．3．1質(zhì)粒構(gòu)建以含人β4GalTⅡ全長cDNA序列為模板，設(shè)計2對引物，使用PrimerSTAR?HS DNA Polymerase進(jìn)行PCR，分別擴(kuò)增出β4GalTⅡ-FLAG和β4GalTⅡ，引物序列見表1。將PCR所得產(chǎn)物用1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，按照膠回收試劑盒方法進(jìn)行純化回收。純化回收的β4GalTⅡ-FLAG和pcDNA3．1（＋）載體分別用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切；純化回收的β4GalTⅡ和pCDGFP載體分別用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切后的片段和載體經(jīng)DNA凝膠純化后分別連接，得到pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG和pCDGFP-β4GalTⅡ。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海英濰捷基生物工程有限公司測序。測序結(jié)果登錄NCBI與β4GalTⅡ序列作BLAST分析。

表1　引物序列

1．3．2細(xì)胞培養(yǎng)COS7細(xì)胞和HEK 293T細(xì)胞使用含10%胎牛血清、100 U／ml的青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時傳代。選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1．3．3細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h，用胰酶消化細(xì)胞，以1．0×106／cm2的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿，用于免疫熒光實驗的培養(yǎng)皿中預(yù)先放入經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片，用無抗生素的完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)至次日對數(shù)生長期，使細(xì)胞達(dá)到90%以上的匯合度（轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中觀察熒光定位的細(xì)胞匯合度只需要達(dá)到30%～40%的匯合度）。轉(zhuǎn)染實驗根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后4～6 h換新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行免疫熒光制片，用熒光顯微鏡觀察蛋白的熒光定位或者48 h后收集細(xì)胞，從HEK 293T細(xì)胞中提取蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳以及Western blot檢測。

1．3．4β4GalTⅡ蛋白的表達(dá)和定位取轉(zhuǎn)染后24 h左右的細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS清洗3次，棄去PBS；-20℃預(yù)冷的甲醇固定5 min，吸棄甲醇；70%的乙醇溶液固定5 min，棄乙醇；PBS洗3次，每次5min，棄PBS（若為GFP標(biāo)簽就直接行DAPI染核）；含1%脫脂奶粉的TBST室溫封閉30min，棄封閉液；FLAG一抗（1∶100比例用封閉液稀釋）室溫下孵育2 h，棄一抗；封閉液清洗3次，每次5 min；將TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶100）室溫下孵育1 h，棄二抗；PBS洗3次，每次5 min；0．5μg／ml的DAPI溶液100μl室溫染核2 min，棄DAPI；PBS洗3次，每次5 min；用濾紙吸盡蓋玻片上的殘液，用熒光封片膠（Dako）將蓋玻片封于潔凈的載玻片上；4℃避光儲存，次日在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1．3．5Western blot檢測轉(zhuǎn)染48 h后，收集HEK 293T細(xì)胞以提取總蛋白。加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min；4℃、14 000 r／min離心15 min；取適量上清液加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min后冰浴冷卻；經(jīng)12%SDSPAGE凝膠電泳分離后，100 V恒壓電轉(zhuǎn)1 h至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h；加入FLAG一抗或GFP一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗或山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋）室溫孵育1．5 h；TBST洗膜后，暗室ECL顯影。實驗重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1β4GalTⅡPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定抽提的重組質(zhì)粒pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG使用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，pCDGFP-β4GalTⅡ則使用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，經(jīng)與DNA Marker比對，一條位于酶切空載體pcDNA3．1 （5 400 bp）、pCDGFP（6 100 bp）處，另一條目的條帶位于1 119 bp處，表明連接成功，見圖1。

3　討論

2．2測序結(jié)果的比對將酶切鑒定正確的兩種不同標(biāo)簽的質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI上公布的β4GalTⅡ進(jìn)行核酸序列和蛋白質(zhì)序列比對，核苷酸序列均與β4GalTⅡ相同，且氨基酸編碼正確。質(zhì)粒測序結(jié)果證實插入片段的測序結(jié)果與β4GalTⅡ全長序列完全一致，說明重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG、pCDGFP-β4GalTⅡ構(gòu)建正確，見圖2。

2.3β4GALTⅡ蛋白在COS7細(xì)胞內(nèi)的定位GFP蛋白在COS7細(xì)胞中的表達(dá)彌散分布在整個細(xì)胞中，但兩種不同標(biāo)簽的β4GALTⅡ蛋白均在COS7細(xì)胞中表達(dá)在細(xì)胞核周圍，并有明顯的塊狀染色，胞核中未見明顯分布，見圖3。

2.4β4GALTⅡ蛋白在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)

經(jīng)過Western blot檢測，在轉(zhuǎn)染pcDNA3．1（＋）空載體的HEK 293T細(xì)胞裂解液泳道內(nèi)未出現(xiàn)泳帶，而轉(zhuǎn)染pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG的HEK 293T細(xì)胞裂解液中檢測到一條約42 ku的條帶，這與β4GalTⅡ-FLAG表達(dá)的蛋白分子量大小一致；與此相對應(yīng)的是，在轉(zhuǎn)染pCDGFP空載體的HEK 293T細(xì)胞裂解液中出現(xiàn)一條約27 ku的條帶，轉(zhuǎn)染 pCDGFP-β4GalTⅡ的HEK 293T細(xì)胞裂解液中檢測到一條約70 ku的條帶，這與GFP綠色熒光蛋白及GFP-β4GalTⅡ融合蛋白的大小也完全一致。結(jié)果表明β4GalTⅡ蛋白在HEK 293T細(xì)胞中能夠有效表達(dá)，見圖4。

本研究將β4GalTⅡ分別與pcDNA3．1（＋）和pCDGFP空載體融合，首次選用貼壁牢固、鋪展較開的COS7細(xì)胞，并且運用免疫熒光顯微鏡成功地觀察到β4GalTⅡ蛋白在該細(xì)胞內(nèi)的定位情況。加之結(jié)合DAPI染核技術(shù)，細(xì)胞核顯示出藍(lán)色熒光，能夠清楚地展示細(xì)胞核及其周邊情況，從而有效地保證了定位的準(zhǔn)確性。由于蛋白標(biāo)簽的引入可能會對蛋白的定位產(chǎn)生干擾，為了更為直觀地展示出β4GalTⅡ蛋白的定位情況，在構(gòu)建FLAG標(biāo)簽的β4GalTⅡ真核表達(dá)載體進(jìn)行熒光定位的同時，又構(gòu)建了GFP標(biāo)簽的β4GalTⅡ真核表達(dá)載體同步進(jìn)行熒光定位對比。同時輔以GFP空白對照作為報告基因共同研究該蛋白的亞細(xì)胞定位，避免假象干擾實驗，得出錯誤結(jié)論。結(jié)果由圖3可知：GFP蛋白在 COS7細(xì)胞中的表達(dá)彌散分布在整個細(xì)胞中，但兩種不同標(biāo)簽的β4GALTⅡ蛋白在COS7細(xì)胞中均表達(dá)在細(xì)胞核周圍，并有明顯的塊狀染色，熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)超過胞質(zhì)其他部位，胞核中未見明顯分布，定位沒有因標(biāo)簽改變而發(fā)生明顯變化，這些結(jié)果表明，標(biāo)簽融合到主體蛋白β4GALTⅡ中進(jìn)行靶向標(biāo)記并未造成其分子結(jié)構(gòu)的空間位阻，導(dǎo)致熒光蛋白的互補(bǔ)結(jié)合失敗，因而便于筆者后續(xù)研究中通過互換標(biāo)簽方式，正反向檢測與之結(jié)合的蛋白分子間的相互作用。

HEK 293T細(xì)胞作為一種表達(dá)SV40病毒T抗原的細(xì)胞系，增殖速度快，轉(zhuǎn)染效率高，蛋白表達(dá)水平高，較易檢測，非常適用于外源基因的過表達(dá)分析。本研究首次選用HEK 293T細(xì)胞探究β4GalTⅡ蛋白的表達(dá)，圖4顯示兩種標(biāo)簽的β4GalTⅡ蛋白均可在HEK 293T細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，這為該基因在HEK 293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行功能研究的轉(zhuǎn)染表達(dá)實驗提供了依據(jù)。

β1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（β4GalTase）家族迄今為止已知含有7個家族成員（β4GalTⅠ-Ⅶ）。據(jù)氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，β4GalTase家族又可分為4個亞族，屬于Ⅱ型膜蛋白［1，6］。近年來對β4GalTⅠ結(jié)構(gòu)和功能的研究較為廣泛，但對與其同源性最高的β4GalTⅡ的研究還不多。有研究［3，7-8］顯示β4GalTⅡ和β4GalTⅠ、β4GalTⅣ共同參與哺乳動物體內(nèi)大多數(shù)N-寡糖鏈的生物合成，其作用是以催化從UDP-半乳糖苷轉(zhuǎn)移到-N多糖復(fù)合物末端的N-乙酰氨基葡萄糖上，形成β-1，4糖苷鍵，以對蛋白質(zhì)進(jìn)行糖鏈修飾，從而參與糖復(fù)合物的形成。也有研究［5，7］表明，β4GalTⅡ依賴其高爾基復(fù)合體定位發(fā)揮促凋亡作用，同時，該機(jī)制的調(diào)節(jié)是因為β4GalTⅡ可能作為p53轉(zhuǎn)錄因子的靶基因參與了p53介導(dǎo)的由DNA損傷劑誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡。同時，Kouno et al［9］的研究認(rèn)為β4GalTⅡ能與葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（GlcAT-P）形成復(fù)合物，參與HNK-1聚糖的合成，從而間接地參與突觸可塑性及樹突的成熟。還有研究［10］顯示β4GalTⅡ可作為參與聚糖合成的主要調(diào)節(jié)因子，參與神經(jīng)發(fā)育中糖鏈的合成。既往研究［4-6，9］報道β4GalTⅡ蛋白在人類白血病細(xì)胞（K562，K562／ADR，HL60，HL60／ADR，NB4，NB4／ADR，U937，U937／ADR）及骨髓單核細(xì)胞（BMMC）、增殖表皮癌細(xì)胞（Hela）、昆蟲細(xì)胞（Sf-9）、小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（N2a）等多種細(xì)胞中均可表達(dá)且發(fā)揮不同的作用。即使如此，人們對β4GalTⅡ的生理功能尚知之不多，仍在進(jìn)一步探索中。

筆者所在的研究組在早期的酵母雙雜交文庫篩選工作中利用誘餌蛋白篩選到β4GalTⅡ基因的藍(lán)色克隆，因而本研究運用基因克隆技術(shù)構(gòu)建兩種不同標(biāo)簽的β4GalTⅡ真核表達(dá)載體，并首次報道了β4GalTⅡ轉(zhuǎn)染進(jìn)COS7的定位情況，鑒于該蛋白在核周圍明顯的塊狀染色情況，提示其可能定位于某個細(xì)胞器上，關(guān)于其精確的亞細(xì)胞定位尚需β4GalTⅡ與可能的細(xì)胞器特異標(biāo)記分子的共定位實驗進(jìn)行證實。同時也將β4GalTⅡ蛋白首次轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK 293T細(xì)胞內(nèi)，初步探索了人β4GalTⅡ在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。本研究為課題組進(jìn)一步研究β4GalTⅡ的分子功能及其與從人類Hela細(xì)胞的cDNA基因文庫中篩選出該蛋白的誘餌蛋白之間的相互作用及其作用機(jī)制奠定了非常重要的基礎(chǔ)，后續(xù)實驗將對此做更深入的研究。

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Xu Xueqin，Pan Linxin，Geng Huiwu，et al
（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei230032）

The expression and localization ofβ4GalTⅡ in mammalian cell lines

AbstractObjectiveTo construct the eukaryotic expression plasmids tagged FLAG or GFP ofβ4GalTⅡgene by PCR，then the plasmidswere transfected into COS7 cells respectively to investigate the localization of recombinant proteins．They were also transfected into HEK 293T cells to define their expression．MethodsSpecific primers with FLAG or GFP tag were designed forβ4GalTⅡgene．The gene encodingβ4GalTⅡwas amplified directly by PCR using cDNA fragment as template．Then the amplified productswere ligated into the eukaryotic expression vectors pcDNA3．1（＋）and pCDGFP to construct recombinant plasmids．Both of the plasmidswere confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing．The plasmidswere transfected into COS7 and HEK 293T cells respectively via Lipofectamine 2000 Reagent．The localization and expression of the recombinant proteins in cells were examined by the fluorescence microscopy or Western blot．ResultsThe pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG and pCDGFP-β4GalTⅡrecombinant expression vectors were successfully constructed and expressed in eukaryotic cells．The results which observed by the fluorescence microscope demonstrated that bothβ4GalTⅡ-FLAG and GFP-β4GalTⅡproteinswere predominantly detected in the perinuclear spot and showed obvious signs ofmassive dying，and they were not distributed in the nucleus evidently．Western blot identified that both of theβ4GalTⅡtagged FLAG and GFP could express stably in HEK 293T cells．ConclusionConstruction of eukaryotic expression recombinant plasmids ofβ4GalTⅡgene provides some basis for further function studies ofβ4GalTⅡin cells and their interaction with other proteins．

Key wordsβ4GalTⅡ；transfection；cellular localization；protein expression

中圖分類號R 341；R 394．2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1610-05

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（編號：81201368）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)教研室，合肥230032

作者簡介：徐雪琴，女，碩士研究生；