m iR-483-5p通過靶基因ERK1調控人類顆粒細胞增殖凋亡平衡

蔣秀敏，劉雨生，許　波

m iR-483-5p通過靶基因ERK1調控人類顆粒細胞增殖凋亡平衡

蔣秀敏，劉雨生，許波

摘要目的證明miR-483-5p及其靶基因ERK1參與調控人類顆粒細胞增殖凋亡平衡。方法①體外培養人正常顆粒細胞，調控其miR-483-5p超表達，聚合酶鏈反應（PCR）及Western blot法檢測ERK1的mRNA及蛋白表達情況；將包含野生型或突變型的ERK1 mRNA 3′UTR的DNA片段克隆在熒光素酶標記的質粒，共轉染miR-483-5p mimics、controlmiRmimics和野生型、突變型重組質粒，檢測其顆粒細胞相對熒光素酶活性；②將miR-483-5p mimics及ERK1 siRNAs單獨及共同轉染顆粒細胞，MTT法及TUNEL法分別檢測三種情況下卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡情況。結果①miR-483-5p超表達后，ERK1基因及蛋白表達均下降；與control-Wt（野生型）轉染組相比，miR-483-Wt組的熒光素酶活性顯著降低；miR-483-Mut（突變型）與control-Mut轉染組間熒光素酶活性的比較差異無統計學意義；②miR-483-5p mimics與ERK1 siRNAs單獨及共同轉染顆粒細胞，三種轉染條件下顆粒細胞增殖均顯著受抑制、凋亡率顯著升高，且三種作用效果差異無統計學意義。結論miR-483-5p通過直接與靶基因ERK1結合，參與調控人類顆粒細胞增殖凋亡平衡。

關鍵詞miR-483-5p；ERK1／2-MAPK通路；顆粒細胞；增殖凋亡平衡

2015-07-27接收

劉雨生，男，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：shengzhizhongxin＠126．com

微小RNA（microRNA，miRNA）作為基因表達的負調控因子，參與了包括分化、增殖、凋亡等過程，進而參與包括胚胎發育、腫瘤發生、壓力應答等幾乎所有的生物學進程［1］。miRNA廣泛參與卵泡發育成熟、受精、著床及早期胚胎發育等過程，維持女性正常生育功能［2-4］。顆粒細胞是卵巢中十分重要的細胞，參與了包括原始卵泡生長啟動、增殖、分化、閉鎖、排卵等全部的卵巢生理過程，與卵巢疾病的發生密切相關［4］。如果顆粒細胞發生大量凋亡，將引起卵泡內局部激素環境變化，進而干擾正常卵泡發育，導致卵巢病理性改變，如多囊卵巢綜合癥（polycystic ovarian syndrome，PCOS）的發生等［5-6］。因此顆粒細胞的增殖-凋亡平衡對生殖功能產生重要的影響。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族中關鍵通路ERK1／2-MAPK信號轉導通路在調控卵巢內顆粒細胞增殖、凋亡、分化中的作用已引起了廣泛關注。研究［1］表明，ERK1／2-MAPK通路參與維持卵巢內顆粒細胞增殖-凋亡的平衡。另有研究［7］表明miR-483-5p在腫瘤中的作用較多，體內外實驗顯示其與癌細胞的增殖、凋亡、細胞周期變化及其遷移、侵襲能力等生物學行為有關；有研究者證明miR-483-5p通過直接調控靶基因血清反應因子（serum response factor，SRF）發揮抑制血管形成的作用［8］。筆者在前期研究［2］中發現，通過比較PCOS和正常人群顆粒細胞內差異表達的miRNA及其下游通路，發現miR-483-5p在PCOS顆粒細胞中表達明顯升高且ERK1的表達明顯下降，并證實顆粒細胞內ERK1的表達變化受到了 miR-483-5p的調控。該研究通過單獨、共同轉染miR-483-5p及siRNAs顆粒細胞后，觀察顆粒細胞的增殖凋亡情況。

1　材料與方法

1．1研究對象卵巢顆粒細胞均來自于安徽醫科大學附屬省立醫院生殖醫學中心，選取的是因男方因素行自然周期單精子卵胞漿內注射與胚胎移植（Intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer，ICSI-ET）而助孕的女方顆粒細胞。按照安徽醫科大學附屬省立醫院倫理委員會規定，入選患者簽署知情同意書。

自然周期選取標準：①所有研究對象無全身及其它婦科、內分泌等疾病；②月經規律；③超聲檢查無多囊卵巢改變；④基礎內分泌無異常；⑤排除糖尿病家族史，空腹血糖水平正常；⑥男方均為重度少弱精癥或梗阻性無精癥；⑦男女雙方無染色體異常；⑧研究對象的年齡均在25～33歲。

1．2主要試劑RPMI-1640（美國Gibco公司）；miR-483-5pmimics、control-miRmimics（Gene Pharma 公 司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；HMA F10（英國 Sigma公司）；SYBR premix Ex TaqTMIIKit（TaKaRa公司）；硝酸纖維素膜（Amersham Biosciences）；抗-ERK1抗體、β-actin抗體（Abcam公司）；羊抗兔IgG抗體（Promega公司）；MTT溶液、DMSO、TUNEL反應混合液（Roche公司）。

1．3方法

1．3．1顆粒細胞的分離及培養自然周期陰道穿刺取卵；獲取的含有成熟卵母細胞的卵丘復合物經機械切割法分離外圍顆粒細胞。用含有20%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養。于37℃、含5%CO2培養箱內原代培養24 h。取對數生長期細胞用于實驗。

1．3．2miRNA及siRNAs轉染至顆粒細胞將miR-483-5pmimics及ERK1 siRNAs單獨及共同轉染至顆粒細胞。將miR-483-5p mimics和 controlmiR mimics分別加入無血清無雙抗培養基EP管中，均勻混合，緩慢加入含2μl LipofectamineTM2000 50μl無血清無雙抗HMA F10培養基中，反復顛倒混勻，在室溫下以使脂質體與類似物或對照形成復合物，在37℃、5%CO2的培養箱中孵育。轉染miR-483-5p mimics組標記為轉染組，轉染controlmiR mimics組標記為對照組。miR-483-5p mimics序列為：5′-AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG-3′；control-miRmimics序列為：5′-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA-3′。

通過聚合酶鏈反應（PCR）法分別檢測轉染組和對照組中的靶基因ERK1 mRNA表達量，通過Western blot分析兩組在轉染后ERK1蛋白的表達情況，同時檢測兩組的顆粒細胞增殖率及凋亡率。轉染siRNAs與轉染miRNA步驟一樣。

1．3．3熒光素酶報告基因的構建和熒光素酶活性檢測將miRNA的靶基因mRNA的3′UTR克隆到熒光素酶報告載體上，熒光素酶報告系統能夠顯示miRNA是否直接結合到這個UTR上。由上海康成生物工程有限公司完成野生型和突變型ERK1 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因質粒的構建和鑒定。取對數生長期的卵丘顆粒細胞，參照脂質體LipofectamineTM2000說明書的操作步驟進行，將 miR-483-5p mimics和control-miR mimics及野生型和突變型ERK1 mRNA 3′UTR共轉染到顆粒細胞中。按雙熒光素酶檢測試劑盒檢測方法進行，在細胞轉染24 h后，加入細胞裂解液和螢火蟲熒光素酶檢測劑100μl，混勻15 min后，檢測螢火蟲熒光素酶活性（Ff），再加入海腎素熒光素酶檢測試劑100μl，測量海腎素熒光素酶活性（Rn）。熒光素酶活性（C）＝Rn／Ff。

1．3．4miRNA及 mRNA表達的檢測分別檢測三種情況下ERK1 mRNA表達量。提取卵丘顆粒細胞總RNA后，首先利用Reverse Transcription Kit對總RNA內待檢測的miR-483-5p進行反轉錄，然后利用SYBR premix Ex TaqTMIIKit檢測miRNA的表達水平，所有步驟均嚴格按照操作手冊進行。其中snRNAU6作為miRNA表達量檢測時的內參，GAPDH作為mRNA的內參。每個樣品的PCR反應平行重復3個孔，所有RT-PCR實驗獨立重復3次。根據待測基因和內參的循環數CT值，按照公式：相對值＝2-ΔΔCT計算出樣本待測基因相對于內參基因的相對表達量。

1．3．5Western blot分析顆粒細胞中加入RIPA裂解液裂解細胞，提取上清總蛋白。蛋白經12% SDS-PAGE 120V電泳，再轉移至硝酸纖維素膜上。轉膜后用5%脫脂牛奶／TBST封閉1 h，然后4℃冰箱中封閉過夜。分別加入抗-ERK1抗體及作為內參的β-actin抗體。然后加入二抗，即用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體，孵育2 h，用TBST洗膜30 min。將洗好的硝酸纖維素膜放入透明的薄膜中，并在其上加入顯色液后，待反應一段時間后，觀察顯色效果。出現合適亮度條帶后用定影液對其進行定影，再清洗后晾干，最后掃描或者拍照保存。

1．3．6MTT法檢測細胞增殖能力選取顆粒細胞，用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，經細胞計數后調整細胞密度至5×104個／ml，然后接種至96孔板，每孔200μl，放入CO2恒溫培養箱中培養3～5 d，每孔加入MTT溶液20μl繼續孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加 150μl的DMSO，然后將 96孔板放在搖床上勻速搖晃10 min，分別在24、48、72 h檢測492 nm處各孔吸光度，計算其細胞增殖率。

1．3．7TUNEL檢測細胞凋亡顆粒細胞接種在預置有滅菌玻片的24孔培養板中，細胞計數控制密度在5×104／m l，用含10%熱滅活胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養液中，將爬片擦干后放置于濕盒上，用TBS1～100新鮮稀釋的蛋白酶K室溫下處理30 min，處理組加入TUNEL反應混合液（50μl TdT和450μl熒光素標記的dUTP液混勻），以50μl／片的量滴入爬片；而陰性對照組滴入50μl熒光素標記的dUTP；陽性對照組滴入50μl DNasel緩沖液，用甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。結果判定：每個樣本隨機觀察20個視野，分別對凋亡細胞數和總細胞進行計數，并計算調亡率。分別在轉染后的24、48、72 h檢測顆粒細胞凋亡率。

1．4統計學處理采用SPSS 17．0統計軟件進行分析，數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2　結果

2.1證實m iRNA-483-5p調控 ERK 1的表達通過miRNA-483-5p mimics轉染顆粒細胞，檢測miRNA-483-5p超表達后的ERK1 mRNA和蛋白的表達水平。PCR和Western blot結果顯示，miRNA-483-5p轉染顆粒細胞后ERK1 mRNA和蛋白表達均下降，見圖1A、1B。進一步將包含野生型或突變型的ERK1 mRNA 3′UTR的DNA片段克隆在熒光素酶標記的質粒，共轉染了miR-483-5p mimics、controlmiRmimics和野生型／突變型重組質粒，檢測其顆粒細胞相對熒光素酶活性，與control-Wt轉染組相比，miR-483-W t組的熒光素酶活性顯著降低；miR-483-Mut與control-Mut轉染組間熒光素酶活性的比較差異無統計學意義，見圖1C、1D。

2.2過表達 m iR-483-5p及 ERK1 siRNAs對顆粒細胞體外增殖影響在顆粒細胞單獨轉染miR-483-5pmimics及ERK1 siRNAs的24、48、72 h，MTT法分別檢測不同時間細胞的增殖率，與對照組相比，單獨轉染miR-483-5p mimics及ERK1 siRNAs均明顯抑制顆粒細胞的增殖率（P＜0．05），見圖2A、2B，且隨著時間延長其抑制越明顯。

2.3TUNEL染色檢測轉染m iR-483-5p m im ics及ERK1 siRNAs后顆粒細胞的凋亡情況與對照組相比，兩組的凋亡率明顯升高，同時隨著時間延長其凋亡率越高，見圖3、表1。

表1　轉染m iR-483-5p m im ics及ERK 1 siRNAs后顆粒細胞的凋亡率（%）

2.4單獨及共同轉染m iR-483-5p與ERK1 siRNAs對顆粒細胞增殖凋亡平衡的影響MTT法檢測結果顯示，與對照組比較，轉染miR-483-5p、轉染ERK1 siRNAs及共同轉染miR-483-5p和ERK1 siR-NAs均明顯抑制顆粒細胞的增殖率，且三組之間差異無統計學意義（F＝31．76，P＜0．05），圖4A；TUNEL法檢測三組顆粒細胞的凋亡率均明顯升高，見圖4B，且三組之間差異無統計學意義（F＝315．58，P＜0．05）。

3　討論

miRNA是一種內源性的非編碼小RNA（18～25個核苷酸）通過降解靶mRNA或抑制其翻譯，對基因進行轉錄后水平的調控。在前期研究中，通過繪制的人類卵丘顆粒細胞差異表達miRNA圖譜發現，顆粒細胞內miRNA通過調控能量／氨基酸代謝、免疫調節、激素調控、細胞分化等多個通路，參與了卵母細胞和卵泡的發生與發育［4］。進一步通過分析PCOS患者和正常對照人群顆粒細胞內差異表達的miRNA及下游通路，發現miR-483-5p在PCOS顆粒細胞中表達明顯升高，且通過調節靶基因ERK1 （MAPK3）表達參與下游MAPK信號通路的調控［2］。本研究結果表明miR-483-5p能下調ERK1在卵巢顆粒細胞中的表達。在此基礎上利用雙熒光素酶報告系統結合miRNA-mRNA結合位點突變等方法進一步確認miR-483-5p對于靶基因ERK1表達的抑制是通過直接結合而抑制的。

顆粒細胞具有分泌性腺激素維持卵巢功能的能力，在卵泡的正常發育中起著重要的作用。在需要進行輔助生殖的人群中發現，顆粒細胞凋亡直接影響IVF-ET的結局與妊娠成功率［9］。這些證據表明顆粒細胞的增殖-凋亡平衡對于卵巢內的激素微環境、卵子和卵子的發育及后期胚胎的形成和生長都具有極其重要的影響。Amhr2-cre-Dicer1條件性敲除小鼠模型的研究［10］表明miRNA在卵巢體細胞中的缺失會導致原始卵泡形成增多、早期卵泡激活加速以及閉鎖卵泡增多等多種表型，與卵泡發育相關基因等也同時發生了顯著性的變化。本研究中通過人為調控對miR-483-5p進行超表達，結果表明超表達后顆粒細胞增殖受抑制，凋亡率增加。這些結果表明卵巢顆粒細胞內的miRNA對于卵母細胞、卵泡的生長發育有著不可替代的調控作用［1-4］。

ERK1／2-MAPK通路是細胞表面信號傳導至細胞核的重要傳遞者，通過影響基因的轉錄和表達進而影響細胞的增殖、分化、凋亡、轉化等關鍵過程［11-12］。顆粒細胞ERK1／2-MAPK通路在促卵泡刺激素（FSH）及生長因子介導的顆粒細胞增殖過程中發揮重要作用，并且ERK1／2-MAPK通路的持續激活可以阻止細胞凋亡的發生［11-12］。利用ERK1／2特異性抑制劑U0126抑制ERK1／2的活性會抑制FSH對顆粒細胞增殖的促進作用，并且抑制顆粒細胞內激素的正常分泌［13］。有研究［14］顯示，卵巢內顆粒細胞的異常狀態與MAPK通路的失調直接相關。在顆粒細胞內，ERK1／2的激活導致下游絲氨酸／蘇氨酸激酶P90RSK蛋白、轉錄因子-3 （Stat3）等磷酸化而激活轉錄，從而促進細胞生長和增殖。同時，活化后的ERK1可以促進細胞周期素D1（CylinD1）與細胞周期蛋白依賴性激酶-4 （CDK4）的結合進而調控細胞周期［1］。這些證據表明，ERK1／2-MAPK通路參與維持卵巢內顆粒細胞增殖-凋亡的平衡。前期研究［2］顯示，PCOS患者顆粒細胞內ERK1的表達和對照組相比出現明顯的下降，并證實顆粒細胞內 ERK1的表達變化受到了miR-483-5p的調控。與之相對應的，本研究顯示miR-483-5p mimics轉染和ERK1 siRNAs單獨及兩者共同處理顆粒細胞后，檢測ERK1／2-MAPK通路關鍵分子的表達和活性，結果顯示顆粒細胞的增殖能力明顯下降，而凋亡比例明顯升高，且不論單獨及共同處理其作用差異無統計學意義，這表明miR-483-5p下調ERK1表達參與顆粒細胞增殖凋亡平衡與ERK1 siRNAs的轉染抑制ERK1表達參與顆粒細胞增殖凋亡機制在一條通路上。這些結果進一步證實miR-483-5p直接調控ERK1，參與調控卵巢內顆粒細胞增殖、凋亡等關鍵過程。

維持顆粒細胞增殖-凋亡平衡是正常卵泡發育的必要條件，該平衡的失調對于卵巢內的激素微環境、卵子和卵子的發育及后期胚胎的形成和生長都具有極其重要的影響。同時顆粒細胞增殖與凋亡平衡的維持是一個多因素調控的復雜過程，miRNA、mRNA、蛋白質構成了復雜而精密的調控網絡。平衡一旦被打破，卵巢功能就會出現異常，不但會導致生殖功能異常，同時還會引起代謝失調等其他并發癥。因此，了解miR-483-5p及其下游靶基因和通路在維持顆粒細胞增殖-凋亡平衡中的作用，將為研究卵巢、卵泡、卵子的發育和調控以及相關疾病研究提供新的思路和研究手段，有助于了解miRNA在雌性生殖細胞發育及相關生殖過程中的作用。

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Characterization ofm iRNA-483-5p and targeted gene ERK1 in the regulation of proliferation-apoptosis balance of human granulosa cells

Jiang Xiumin，Liu Yusheng，Xu bo
（Reproductive Medicine Center，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo demonstrate thatmiR-483-5p and its targeted gene ERK1 involved in the regulation of proliferation and apoptosis of human granulosa cells．Methods①The ERK1 mRNA and protein level expression were detected by PCR and Western blot aftermiR-483-5p overexpression in vitro normal human granular cells．Detected the relative luciferase density after cotransfectingmiR-483-5p mimics and its control respectively with wild or mutant ERK1 mRNA 3｀UTR cloned luciferase report vector in granular cells．②Granular cells proliferation and apoptosis were detected by MTT and TUNEL after transfectingmiR-483-5p mimics or ERK1 siRNAs alone or simultaneously．Results①It showed thatboth ERK1 mRNA and protein in granular cellsweremarkedly downregulated after the transfection ofmiR-483-5pmimics．A significant relative luciferase activity decrease were detected in the granular cells co-transfected with ERK1 wild and miR-483-5p mimics comparison with the controlmimics，but not in the cells co-transfected with the ERK1 mutant andmiR-483-5pmimics．②WhenmiR-483-5p mimicsand ERK1 siRNAs were alone or co-transfected into granular cells，the proliferation was inhibited while apoptosis trend was monitored to be promoted in all cases．No obvious statistic difference was shown between each other．Conclusion MiR-483-5p is involved in the regulation of the proliferation and apoptosis of human granulosa cells by directly binding to the target gene ERK1．

Key wordsmiR-483-5p；ERK1／2-MAPK pathway；granular cells；proliferation-apoptosis balance

中圖分類號R 715．5；R 329．5

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1639-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：81370757）

作者單位：安徽醫科大學附屬省立醫院生殖中心，合肥230001

作者簡介：蔣秀敏，女，碩士研究生；