臍血移植患者T淋巴細胞內細胞因子的特性研究

楊會志，朱小玉，汪　健，孫自敏

臍血移植患者T淋巴細胞內細胞因子的特性研究

楊會志，朱小玉，汪健，孫自敏

摘要目的探討異基因臍血移植后外周血T淋巴細胞免疫功能的特點及規律。方法11例異基因臍血移植患者分別在移植前、移植后30、60和90 d取外周血，將其中T淋巴細胞在莫能霉素存在的情況下，體外經十四烷酰拂波醇乙脂和離子霉素刺激后，分別進行CD4-FITC、CD8-FITC熒光單抗染色和γ-IFN-PE、IL-4-PE熒光單抗胞內染色，最后進行流式細胞儀分析。結果臍血移植后60 d的T淋巴細胞分泌γ-IFN和IL-4的比率開始增加，90 d后T淋巴細胞分泌γ-IFN和IL-4的比率增加明顯（P＜0．001）。結論臍血移植60 d后患者的免疫功能開始恢復，90 d后免疫功能達到頂峰，臍血移植是治療急性白血病的一種有效方法。

關鍵詞異基因臍血移植；T淋巴細胞；細胞因子

2015-06-29接收

自從法國Gluckman教授于1988年完成了世界首例異基因臍血移植后，世界各地相繼運用該技術成功治療血液系統惡性病、惡性實體瘤及遺傳性疾病等多種疾病。臍血移植的安全性和有效性在臨床實踐中不斷得到驗證，與其他類型造血干細胞移植相比，人體臍血移植的移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GVHD）發生率較低且嚴重程度相對較弱［1］。但臍血移植患者造血重建和免疫恢復相對延遲，存在一定程度的免疫缺陷狀態，這都使受者對各種微生物的易感性增加，易患致命性細菌、霉菌及病毒感染［2］，導致移植失敗。因此研究臍血移植前后外周血T淋巴細胞免疫活性恢復情況非常重要。該研究利用流式細胞儀技術檢測臍血移植患者移植前后T淋巴細胞胞內細胞因子的變化及其分布格局，探討臍血移植后的免疫重建特性，了解可能的發生機制。

1　材料與方法

1．1病例資料選取安徽醫科大學附屬省立醫院2013年1月～2014年7月11例異基因臍血移植患者，分別取患者移植前以及移植后30、60和90 d的外周血T淋巴細胞。采用環胞素＋驍悉預防GVHD；如發生GVHD，加用甲強龍干預，干預后可抑制過強的免疫功能。

1．2實驗方法采用微量全血法采集標本，細胞因子檢測所需試劑和儀器主要為流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞分泌的干擾素（interferon，IFN）和白介素（interleukin，IL）兩種細胞因子。取0．5 m l經肝素抗凝的外周血加入0．5 ml IMDM完全培養基，5%CO2孵育5 h加紅細胞裂解液5 000 r／min離心1 min，棄上清液備用。分別加抗CD4-FITC、CD8-FITC熒光單抗，4℃避光靜置30 min，用染色緩沖液清洗，加質量濃度為1%PFA-PBG每管50μl，4℃過夜。再用穿孔緩沖液洗1次，每管加200μl穿孔液，室溫靜置20 min，5 000 r／min離心1 min棄去上清液。加熒光素標記的抗淋巴因子抗體：每管各加200 ng（5～10μl）標記物和等量穿孔緩沖液，室溫孵育30 min，分別用穿孔緩沖液洗1次，染色緩沖液洗1次。用質量濃度為0．5%PFA-PBS，制備懸浮細胞，置與流式細胞儀上進行檢測。根據檢測獲取的數據，用CBA軟件自動繪制標準曲線，根據標準曲線自動計算出樣本中各細胞因子含量。

1．3統計學處理使用SPSS 13．0進行統計學處理，計量資料描述用±s表示；對重復測量資料比較采用單因素重復測量方差分析，γ-IFN和IL-4的變化關系采用相關性分析。

2　結果

2.1異基因臍血移植后T淋巴細胞免疫系統重建特性T淋巴細胞分泌的γ-IFN和IL-4經流式細胞儀檢測（圖1），患者臍血移植前外周血中CD4＋T細胞和CD8＋T細胞胞內分泌的γ-IFN和IL-4比率分別為（3．97±0．98）、（3．62±0．79）和（2．81± 0．42）、（4．48±1．45）。相對于移植后30 d，移植后60、90 d的CD4＋T細胞和CD8＋T細胞胞內分泌的γ-IFN和IL-4均逐漸增高，Linear趨勢檢驗結果顯示差異均有統計學意義（P＜0．001）。

2.2γ-IFN和IL-4變化的相關性分析經相關分析，異基因臍血移植患者γ-IFN和IL-4變化呈正相關性（r＝0．789，P＜0．001）。見圖2。

3　討論

異基因造血干細胞移植是現今治愈血液病最安全有效的方法。由于人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）嚴格相合的血緣及非血緣骨髓供者嚴重不足而極大地限制了移植的廣泛開展。而感染和免疫重建是影響移植療效的另一個主要因素，感染相關的死亡大多發生于移植后3～4個月。故應密切監測免疫重建進程，并根據檢測結果及時調整治療方案，從而提高人體臍血移植的成功率。免疫重建過程中的細胞因子的檢測方法較多，而流式細胞儀雙標記法檢測是目前國內外最經典方法，不僅可以準確地反映單一細胞分泌細胞因子的能力，而且又能反映具有分泌細胞因子能力的特定細胞群及細胞數量，是目前國際上常用的測定T淋巴細胞功能亞群、活化狀態、分化情況的一種先進的方法［3］。

表1　臍血移植患者移植前后胞內　γ-IFN和　IL-4的變化情況（n＝11）

T淋巴細胞亞群繁多，功能各異，按其胞內分泌的細胞因子譜的不同至少可分為兩種功能截然不同的亞群，即Th1和Th2。Th1亞群主要分泌IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ；Th2亞群主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。在Th1亞群中以IFN-γ分泌為主要特征，參與細胞免疫反應，是引發GVHD的主要細胞亞群，在造成GVHD的“細胞因子風暴”中，Th1分泌的細胞因子起著關鍵作用。而Th2亞群中以IL-4的分泌最富代表性，主要參與體液免疫應答。Th1和Th2亞群之間還存在拮抗作用，分泌的細胞因子均可刺激自身的分化與發展而抑制對方的分化與發展［4-6］。

白血病患者因為本身免疫受損，功能低下，導致T淋巴細胞功能降低，本實驗也表明，臍血移植前T淋巴細胞分泌的γ-IFN和IL-4較正常人弱［7］，顯示白血病患者自身的T淋巴細胞免疫功能下降。移植后30 d，T淋巴細胞分泌γ-IFN和IL-4的比率較移植前繼續下降，顯示患者此時處于免疫功能缺乏狀態。臍血移植后60 d后T淋巴細胞分泌γ-IFN 和IL-4的比率開始增加，顯示T淋巴細胞免疫功能開始恢復，特別是Th2亞群細胞恢復較快。90 d后T淋巴細胞分泌γ-IFN和IL-4的比率增加明顯，本次研究顯示，IFN-γ和IL-4的增加變化呈正相關性，提示Th1和Th2免疫功能同步恢復。但是γ-IFN的分泌量較IL-4的分泌量增加顯著，顯示一種優勢明顯的細胞因子分泌狀態。由于90 d后T淋巴細胞的這種功能增加可能是GVHD發生的原因之一，這與本實驗11例病例中有2例發生GVHD相吻合。本實驗觀察的病例數較少，結果可能有偏移，應加強相關病例數研究。

參考文獻

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［7］楊會志，汪健，孫自敏．急性髓系白血病患者T淋巴細胞內細胞因子表達特性［J］．中國實驗血液學雜志，2007，15（6）：1161-4．

The characteristics of T lymphocyte cytokine in the cord blood transp lantation patients

Yang Huizhi，Zhu Xiaoyu，Wang Jian，et al
（Dept of Hematology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo evaluate characteristics of T-lymphocyte immunologic function and reconstitution after allo-gene cord blood transplantation．MethodsTo peripheral blood from 11 human cord blood at30，60 and 90 days after cord blood transplantation，the T-lymphocytes with phorbol 12-myristate 13-acetate and ionomycin in the presence ofmonensin．CD4＋and CD8＋Tcellswere analyzed forγ-IFN and IL-4 intrecellular production by flow cytometry．ResultsThe rate ofγ-IFN and IL-4 from T lymphocytes began to increase at60 days after the transplantation，and the rate ofγ-IFN and IL-4 increased significantly at90 days after the transplantation（P＜0．001）．ConclusionThe immune function begins to recover at 60 days after the Cord blood transplantation，the immune function peaks after 90 days．Cord blood transplantation is effective for the acute leukemia trerapy．

Key wordsallo-gene cord blood transplantation；T-lymphocytes；cytokines

中圖分類號R 55

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1680-04

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（編號：31101006）

作者單位：安徽醫科大學附屬省立醫院血液科，合肥230001

作者簡介：楊會志，男，副主任醫師，責任作者，E-mail：yanghz69＠sina．com