鬼針草總黃酮部分化學成分研究

鄧子云，陳飛虎，李　寧，高文凡，趙　杰，韓　續，雷　靜，葛金芳，李曉祥

鬼針草總黃酮部分化學成分研究

鄧子云1，陳飛虎1，李寧1，高文凡1，趙杰1，韓續1，雷靜1，葛金芳1，李曉祥2

摘要目的對鬼針草中的化學成分進行分離純化，并篩選出具有抗肝纖維化活性的單體化合物。方法采用大孔樹脂、硅膠、Sephadex LH-20、MCI小孔樹脂、十八烷基硅烷鍵合硅膠柱等柱層析的方法進行分離純化，并利用波譜技術進行化合物的鑒定。應用四甲基偶氮唑藍（MTT）法體外檢測單體化合物對肝星狀細胞T6（HSC-T6）的抑制作用。結果從鬼針草中分離鑒定的化合物為3-羥基乙?；胚幔?）、山奈酚（2）、6，7，3′，4′-四羥基橙酮（3）、槲皮素（4）、奧卡寧（5）、松脂素（6）、1，2，13-三羥基-3，11（E）-十三二烯-5，7，9-三炔（7）、異奧卡寧（8）、鄰苯二甲酸-雙（2′-乙基庚基）酯（9）、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（10）、（2S／2R）-異奧卡寧-7-O-β-D-（2″，4″，6″-三乙酰基）吡喃葡糖苷（11／12）、2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-1，13-二羥基-3，11（E）十三二烯-5，7，9-三炔（13）。結論化合物6，9為首次從鬼針草種屬中分離得到。其中黃酮類化合物2，4具有較強的體外抑制HSC-T6細胞的增殖作用。

關鍵詞鬼針草；化學成分；結構鑒定；肝星狀細胞T6

鬼針草（Bidens bipinnata L．）是菊科一年生草本植物，分布在亞洲的熱帶和亞熱帶地區，在我國的華東、華中、華南、西南各省區也有較為廣泛的分布。鬼針草為我國民間常用草藥，有解熱清毒、散瘀活血的功效，常用于呼吸道感染、急性黃疸型肝炎、胃腸炎、風濕關節疼痛等的治療。研究［1］表明鬼針草具有抗炎、抗糖尿病、抗高血壓、抗肝纖維化等作用。為了明確鬼針草藥效的物質基礎，該研究對鬼針草總黃酮提取物的化學成分進行了系統的分離，并將得到的化合物進行初步的活性的篩選，為進一步開發鬼針草提供科學依據。

1　材料與方法

1．1藥材

鬼針草于秋季采自安徽省績溪縣，經安徽醫科大學藥學院中藥學教研室張群林教授鑒定，屬于菊科鬼針草屬鬼針草Bidens bipinnata L．。

1．2儀器與試劑

AM-300、400，DRX-500型核磁共振光譜儀（瑞士Bruker公司，四甲基硅烷作為內標）；HPD 100大孔樹脂（河北寶恩公司）；Sephadex LH-20（瑞典GEHealthcare Bio-Sciences公司）；MCI小孔樹脂（日本Mitsubishi Chemical公司）；十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（octadecylsilyl，ODS，日本Fuji Silysia Chemical公司）；柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜GF254硅膠板（煙臺江友硅膠開發有限公司）；氘代試劑（美國Sigma-aldrich公司）；肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）-T6細胞株（南京凱基生物科技發展有限公司）；轉化生長因子-β1（美國PeproTech公司）；胎牛血清、DMEM高糖液體培養基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMSO、四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Sigma公司）；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）（北京世紀奧科生物技術有限公司）。

1．3方法

1．3．1分離提取

鬼針草干燥全草55 kg用70%乙醇溶液提取2次，提取液蒸發至無醇味后過HPD 100大孔樹脂，用三倍柱體積雙蒸水和70%乙醇溶液作為洗脫劑，收集70%乙醇溶液洗脫部分，蒸干后得到浸膏1．8 kg。浸膏用水分散，再次過HPD 100大孔樹脂，用10%～100%乙醇溶液進行洗脫，共得到5個部分，標記為B1-B5。B4（120 g）部分經正相硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯－甲醇系統洗脫，得到4個部分，標記為 B4（1）-B4（4）。B4（2）部分經Sephadex LH-20吸附，用水-甲醇系統梯度洗脫得到化合物1（11．45 mg）和化合物7（28．27 mg）。B4（3）部分經Sephadex LH-20、MCI（0～100%甲醇）梯度洗脫得到化合物2（6．65 mg）。B4 （4）部分經Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫得到B4（4）-1和 B4（4）-2。B4（4）-1部分經Sephadex LH-20吸附，用純乙醇系統洗脫得到化合物4（12．4 mg）和化合物5（16．5 mg）。B4（4）-2經

2015－03－31接收

室，合肥230032

2安徽省新星藥物開發有限責任公司，合肥200060

1．3．2MTT法檢測細胞增殖

取對數增殖期的HSC-T6細胞，以5 000個／孔的細胞密度接種于96孔培養板中，空白對照組加入等量培養基不接種細胞，放入37℃、5%CO2培養箱中12 h細胞貼壁后，空白對照組加入等體積的培養基，藥物組加入等體積不同濃度的藥物（藥物終濃度為12．5、25、50、100、200μmol／L）培養48 h后，每孔加入20 ml MTT溶液（5 mg／m l），在37℃、5%CO2的培養箱中繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加入150 ml DMSO，震蕩10 min后用酶標儀測定490 nm處各孔的吸光度（absorbance，A）值。

2　結果

2．1結構鑒定

化合物1：白色結晶狀粉末，分子式為C10H9NO2，1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ：8．22 （m，1H，H-4），8．17（s，1H，H-2），7．45（m，1H，H-7），7．22（m，2H，H-5，H-6），4．72（s，2H，-CH2OH）。13C-NMR（101MHz，MeOD）δ：195．93（C ＝O），138．16（C-7a），133．98（C-2），126．88（C-3a），124．34（C-4），123．26（C-5），122．63（C-6），114．82（C-3），112．92（C-7），66．24（-CH2OH）。以上數據與文獻［2］對比，確定化合物 1為 3-羥基乙?；胚帷?/p>

化合物2：黃色粉末，分子式為C15H10O6，1HNMR（400 MHz，Acetone）δ：12．17（s，1H，OH-5），8．16（d，J＝8．5 Hz，2H，H-2′，H-6′），7．02（d，J＝8．5 Hz，2H，H-3′，H-5′），6．54（d，J＝2．0 Hz，1H，H-6），6．27（d，J＝2．0 Hz，1H，H-8）。13C-NMR（101 MHz，Acetone）δ：177．01（C-4），165．51（C-7），160．65（C-5），159．91（C-4′），158．80（C-2），158．10 （C-9），136．45（C-3），130．98（C-2′，C-6′），123．78（C-1′），116．84（C-3′，C-5′），104．35（C-10），99．68（C-6），95．01（C-8）。以上數據與文獻［3］對比，確定化合物2為山奈酚。

化合物3：紅色粉末，分子式為C15H10O6，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紅色。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ：7．52（s，1H，H-2′），7．39（d，J＝8．2 Hz，1H，H-6′），7．18（d，J＝8．3 Hz，1H，H-4），6．86 （d，J＝8．2 Hz，1H，H-5′），6．71（d，J＝8．2 Hz，1H，H-5），6．60（s，1H，H-10）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ：185．27（C-3），156．84（C-6），156．10（C-8），149．35（C-4′），147．95（C-2），146．64（C-3′），131．43（C-7），126．48（C-6′），125．60（C-1′），119．31（C-2′），116．90（C-4），116．67（C-5′），116．22（C-9），114．73（C-10），113．58（C-5）。以上數據與文獻［4］對比，確定化合物3為6，7，3′，4′-四羥基橙酮。

化合物 4：淡黃色粉末，分子式為C15H10O7，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紅色。1H-NMR（400 MHz，Acetone）δ：7．83（d，J＝2．0 Hz，1H，H-2′），7．70 （dd，J＝8．5，2．0 Hz，1H，H-6′），6．99（d，J＝2．0 Hz，1H，H-5′），6．52（d，J＝2．0 Hz，1H，H-8），6．26（d，J＝2．0 Hz，1H，H-6）。13C-NMR（101 MHz，Acetone）δ：176．76（C-4），165．14（C-7），162．52（C-5），157．95（C-9），148．53（C-4′），147．13（C-2），146．01（C-3′），136．96（C-3），123．97（C-1′），121．65（C-6′），116．43（C-5′），115．97（C-2′），104．34（C-10），99．34（C-6），94．65 （C-8）。以上數據與文獻［5］對比，確定化合物4為槲皮素。

化合物5：橘紅色粉末（甲醇），分子式為C15H12O6，10%硫酸乙醇溶液顯色呈黃色。1H-NMR（400 MHz，Acetone）δ7．74（d，J＝15．3 Hz，2H，H-α，H-β），7．65（d，J＝7．4 Hz，1H，H-5′），7．33（d，J ＝1．8 Hz，1H，H-2），7．19（dd，J＝1．8，8．2 Hz，1H，H-6），6．88（d，J＝8．2 Hz，1H，H-5），6．48 （d，J＝8．9 Hz，1H，H-6′）。13C-NMR（101 MHz，Acetone）δ：193．35（C＝O），154．20（C-2′），152．53（C-3′），149．21（C-4），146．35（C-β），145．52（C-4′），133．18（C-3），128．19（C-1），123．51（C-6），123．15（C-5′），118．38（C-а），116．45（C-2），116．03（C-5），114．73（C-1′），108．27（C-6′）。以上數據與文獻［6］對比，確定化合物5為2′，3′，4′，3，4-五羥基查爾酮（奧卡寧）。

化合物6：棕黃色粉末，分子式為C20H22O6，10%硫酸乙醇溶液顯色呈色黃色。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ：6．94（d，J＝1．7 Hz，2H，H-2，2′），6．81（dd，J＝8．2，1．7 Hz，2H，H-6，6′），6．78（d，J＝8．2 Hz，2H，H-5，5′），4．68（d，J＝4．2 Hz，2H，H-7，7′），4．20（dd，J＝8．2，6．7 Hz，2H，H-9a，9′a），3．84（s，6H，2×OCH3），3．33 （m，2H，H-9b，9′b），3．11（m，2H，H-8，8′）。13CNMR（101 MHz，MeOD）δ149．06（C-3，3′），147．24（C-4，4′），133．76（C-1，1′），120．02（C-6，6′），116．05（C-5，5′），110．90（C-2，2′），87．44（C-7，7′），72．56（C-9，9′），56．36（-OCH3），55．30（C-8，8′）。以上數據與文獻［7］對比，確定化合物6為松脂素。

化合物7：黃色粉末，分子式為C13H12O3，1HNMR（400 MHz，MeOD）δ6．49（d，J＝16．3 Hz，1H，H-12），6．50（m，1H，H-3），5．88（d，J＝18．3 Hz，1H，H-4），5．82（s，1H，H-11），4．16 （m，3H，H-1a，H-13a，H-2），3．38（m，2H，H-1b，H-13b）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ150．31（C-12），150．25（C-4），109．30（C-3），107．76（C-11），78．29（C-10），78．08（C-9），75．04（C-8），74．69 （C-7），73．35（C-2），66．63（C-6），66．45（C-5），66．39（C-13），62．59（C-1）。以上數據與文獻［8］對比，確定化合物7為1，2，13-三羥基-3，11（E）-十三二烯-5，7，9-三炔。

化合物8：棕黃色粉末，分子式為 C15H12O6，1HNMR（400 MHz，MeOD）δ：7．25（d，J＝8．7 Hz，1H，H-5），6．95（d，J＝1．7 Hz，1H，H-2′），6．81 （dd，J＝8．1，1．7 Hz，1H，H-6′），6．75（d，J＝8．1 Hz，1H，H-5′），6．48（d，J＝8．7 Hz，1H，H-6），5．31（dd，J＝12．2，3．0 Hz，1H，H-2），3．02（dd，J ＝16．8，12．6 Hz，1H，H-3ax），2．67（dd，J＝16．9，3．0 Hz，1H，H-3eq）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ：194．07（C-4），153．97（C-7），152．65（C-9），146．84（C-4′），146．39（C-3′），133．92（C-8），131．86（C-1′），119．59（C-6′），119．35（C-5），116．19（C-5′），115．61（C-10），114．98（C-2′），110．87（C-6），81．50（C-2），44．97（C-3）。以上數據與文獻［9］對比，確定化合物8為異奧卡寧。

化合物9：淡黃色油狀液體，分子式為C26H42O4，1H-NMR（300 MHz，DMSO）δ：7．67（dd，J＝6．0，3．2 Hz，2H，H-3，6），7．66（dd，J＝6．0，3．2 Hz，2H，H-4，5），4．10（m，4H，H-1′，1″），1．52 （m，2H，H-2′，2″），1．23（m，18H，10×CH2），0．86（t，J＝4．2 Hz，6H，H-9′，9″），0．82（t，J＝3．6 Hz，6H，H-7′，7″）。13C-NMR（75 MHz，DMSO）δ：167．02（C＝O），131．73（C-1，2），131．64（C-4，5），128．69（C-3，6），67．43（C-1′，1″），38．10（C-2′，2″），29．82（C-3′，3″），29．06（C-4′，4″），28．39（C-5′，5″），23．27（C-6′，6″），22．43（C-8′，8″），13．93 （C-7′，7″），10．83（C-9′，9″）。以上數據與文獻［10］對比，確定化合物9為鄰苯二甲酸-雙（2′-乙基庚基）酯。

化合物10：黃色粉末，分子式為 C21H20O10，1HNMR（300 MHz，MeOD）δ：7．71（d，J＝8．8 Hz，2H，H-2′，6′），6．88（d，J＝8．8 Hz，2H，H-3′，5′），6．30（d，J＝2．0 Hz，1H，H-8），6．13（d，J＝2．0 Hz，1H，H-6），5．33（d，J＝1．6 Hz，1H，H-1″），4．20（dd，J＝3．3，1．7 Hz，1H，H-2″），3．70（d，J ＝3．3 Hz，1H，H-3″），3．29（m，1H，H-4″），3．27 （m，1H，H-5″），0．89（d，J＝5．6 Hz，2H，H-6″）。13C-NMR（75 MHz，MeOD）δ：179．52（C-4），165．86（C-7），163．13（C-5），161．49（C-4′），159．18（C-2），158．45（C-9），136．17（C-3），131．88（C-2′，6′），122．59（C-1′），116．46（C-3′，5′），105．86（C-10），103．44（C-1″），99．82（C-6），94．75（C-8），73．17（C-4″），72．08（C-3″），71．98 （C-5″），71．90（C-2″），17．64（C-6″）。以上數據與文獻［11］對比，確定化合物10為山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物11／12：淺黃色粉末，分子式為C27H28O14，1H-NMR（300 MHz，MeOD）δ：7．36（d，J＝8．8 Hz，1H，H-5），6．98（d，J＝1．7 Hz，1H，H-2′），6．88（d，J＝8．4 Hz，1H，H-6），6．85（d，J＝7．9 Hz，1H，H-5′），6．80（dd，J＝8．0，1．8 Hz，1H，H-6′），5．42（dd，J＝9．5，8．0 Hz，1H，H-2″），5．16（d，J＝7．6 Hz，1H，H-1″），5．08（dd，J＝16．5，7．0 Hz，1H，H-4″），5．01（dd，J＝12．4，2．8 Hz，1H，H-6″b），4．30（dd，J＝12．2，5．2 Hz，1H，H-6″a），4．12（dd，J＝12．4，2．0 Hz，1H，H-6″b），4．09～3．99（m，1H，H-3″），3．85-3．75（m，1H，H-5″），3．12（dd，J＝16．6，11．9 Hz，1H，H-3），2．82（dd，J＝16．6，2．8 Hz，1H，H-4），2．06 （s，3H，CH3，OAc），2．02（s，3H，CH3，OAc）。13C-NMR（75 MHz，MeOD）δ：193．98（C-4），172．27（C＝O，OAc），172．01（C＝O，OAc），171．44 （C＝O，OAc），152．66（C-），152．50（C-9），151．80 （C-7），147．81（C-3′），146．97（C-4′），146．50（C-5′），136．65（C-8），131．62（C-1′），119．62（C-6′），118．35（C-5），116．22（C-10），115．03（C-2′），110．60（C-6），101．98（C-1″），81．69（C-2），75．38 （C-2″），73．11（C-3″），72．76（C-5″），69．94（C-4″），63．17（C-6″），44．92（C-3），21．29（CH3，OAc），20．77（CH3，OAc），20．63（CH3，OAc）。以上數據與文獻［12］對比，確定化合物11／12為（2S／2R）-異奧卡寧-7-O-β-D-（2″，4″，6″-三乙?；┻拎咸擒?。

化合物13：黃色粉末，分子式為C19H22O7，1HNMR（300 MHz，MeOD）δ：6．40（dt，J＝15．8，4．1 Hz，1H，H-12），6．15（d，J＝1．0 Hz，1H，H-3），6．11（dd，J＝16．0，1．0 Hz，1H，H-4），5．94 （dd，J＝11．1，4．0 Hz，1H，H-11），4．55（d，J＝7．7 Hz，1H，H-1′），4．50（m，1H，H-2），4．26（s，2H，H-13），3．80（m，1H，H-6′a），3．67（s，1H，H-6′b），3．62（d，J＝4．4 Hz，2H，H-1），3．34～3．19（m，4H，H-2′～H-5′）。13C-NMR（75 MHz，MeOD）δ：147．57（C-12），146．62（C-4），109．99 （C-3），109．15（C-11），102．11（C-1′），79．53（C-2），78．82（C-10），78．14（C-9），77．90（C-3′），77．44（C-5′），76．83（C-8），75．57（C-7），75．01（C-2′），71．50（C-4′），67．10（C-6），65．71（C-5），62．59（C-1），62．02（C-6′），19．09（C-13）。以上數據與文獻［13］對比，確定化合物13為2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-1，13-二羥基-3，11（E）十三二烯-5，7，9-三炔。

2.2抑制HSC-T6增殖活性的篩選

通過MTT法檢測分離提取得到的黃酮類化合物對HSC-T6細胞活性的影響，結果表明與陽性對照藥EGCG比較，化合物2（山奈酚）、4（槲皮素）對HSC-T6細胞具有較強的抑制增殖作用。半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）見表1。

表1　黃酮類化合物對　HSC-T6細胞抑制效應的　IC50值（n＝3，±s）

表1　黃酮類化合物對　HSC-T6細胞抑制效應的　IC50值（n＝3，±s）

化合物　IC50（μmol／L）38．41±9．37 3 ＞200 4 40．44±3．81 5 ＞200 6 58．83±4．48 8 88．10±8．06 10　165．57±6．27 11／12　198．53±9．93 2 EGCG　48．92±5．84

3　討論

肝纖維化是肝臟內彌漫性細胞外基質過度沉積。HSC是細胞外基質的主要來源。正常情況下HSC處于靜止狀態，當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，HSC被激活，其表型由靜止型轉變為激活型，并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，合成細胞外基質增多導致肝纖維化。因此，HSC是肝纖維化的重要參與者［14］。

本課題組前期研究［15］顯示總黃酮提取物對肝纖維化具有一定的治療作用。為了明確鬼針草藥效物質基礎，本實驗對鬼針草總黃酮提取物的化學成分進行了系統的分離，并從四五部分分離得到13個化合物。分別是3-羥基乙?；胚幔?）、山奈酚（2）、6，7，3′，4′-四羥基橙酮（3）、槲皮素（4）、奧卡寧（5）、松脂素（6）、1，2，13-三羥基-3，11（E）-十三二烯-5，7，9-三炔（7）、異奧卡寧（8）、鄰苯二甲酸－雙（2′-乙基庚基）酯（9）、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（10）、（2S／2R）-異奧卡寧-7-O-β-D-（2″，4″，6″-三乙酰基）吡喃葡糖苷（11／12）、2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-1，13-二羥基-3，11（E）十三二烯-5，7，9-三炔（13）。其中化合物6，9為首次從鬼針草種屬中分離得到。將得到的單體化合物進行體外抗纖維化活性篩選，顯示化合物2（山奈酚）、4（槲皮素）具有較強的體外抑制HSC-T6細胞的增殖作用，這為進一步開發鬼針草抗纖維化活性提供科學依據。

參考文獻

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中圖分類號R 348

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1456－05

基金項目：國家“重大新藥創制”科技重大專項課題（編號：2009ZX09103-386）

作者單位：1安徽醫科大學藥學院，安徽天然藥物活性研究省級實驗

作者簡介：鄧子云，女，碩士研究生；陳飛虎，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：cfhchina ＠sohu．com；李寧，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：ln0110 ＠sina．comMCI吸附，用水－甲醇系統梯度洗脫得到化合物3 （24．15 mg）。B5（320 g）部分經正相硅膠柱層析，氯仿－甲醇系統洗脫，得到5個部分，標記為B5 （1）-B5（5）。B5（1）-B5（3）部分經Sephadex LH-20（0～100%甲醇）、MCI（30% ～100%甲醇）、硅膠柱（氯仿甲醇）梯度洗脫得到化合物6（30．02 mg）、化合物8（57．84mg）和化合物9（12．4mg）。B5（4）部分經Sephadex LH-20（0～100%甲醇）、MCI（30% ～100%甲醇）梯度洗脫后，經Sephadex LH-20吸附，用純乙醇系統洗脫得到化合物13（1．83 g）和化合物11／12（25．4 mg）。B5（5）部分經Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫后，經ODS柱吸附，用水－甲醇系統洗脫得到化合物10（60 mg）。

Chem ical constituents from Bidens bipinnata L.

Deng Ziyun，Chen Feihu，Li Ning，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Anhui Provincial Laboratory on Bioactivity of Natural Products，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo isolate and identify chemical constituents from Bidensbipinnata L．and screen for the anti-fibrosis activity．MethodsThe extracts were passed through HPD-100 macroporous resin columns with 100% water and 70%ethanol following bymacro resin HPD-100，silica gel column chromatography，Sephadex LH-20，MCIand ODS chromatography．The structures of the componentswere elucidated by NMRmethods．The proliferation of HSC-T6 cells was evaluated by MTT．Results13 components were isolated from the plant including 3-（hydroxyacetyl）indole（1），Kaempferol（2），6，7，3′，4′-tetrahydroxy-aurone（3），Quercetin（4），Okanin（5），Pinoresinol（6），（3E，11E）-tetradecadiene-5，7，9-tetrayn-1，2，13-triol（7），Isookanin（8），bis（2-ethylheptyl）phythalate（9），kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside（10），（2S／2R）isookanin-7-O-β-D-（2″，4″，6″-triacetyl）glucopyranoside（11／12），2-O-β-D-glucosyltri-deca-3，11E-en-5，7，9-tetrayn-1，13-diol（13）．Conclusion13 components are isolated from Bidens bipinnata L．，among which compounds 6，9 are isolated from this genus for the first time and compounds 2，4 could inhibit the proliferation of HSC-T6 cells．

Key wordsBidens bipinnata L．；chemical compounds；structure identification；HSC-T6 cells