基于金/銀納米三明治結構SERS特性的超靈敏前列腺特異性抗原檢測

封 昭,周 駿*,陳 棟,王少敏,王小軍,謝樹森

(1.寧波大學理學院微電子科學與工程系,浙江寧波 315211; 2.寧波大學醫學院附屬醫院,浙江寧波 315020; 3.福建師范大學醫學光電科學與技術教育部重點實驗室,福建省光子技術重點實驗室,福建福州 350007)

基于金/銀納米三明治結構SERS特性的超靈敏前列腺特異性抗原檢測

封 昭1,周 駿1*,陳 棟1,王少敏2,王小軍2,謝樹森3

(1.寧波大學理學院微電子科學與工程系,浙江寧波 315211; 2.寧波大學醫學院附屬醫院,浙江寧波 315020; 3.福建師范大學醫學光電科學與技術教育部重點實驗室,福建省光子技術重點實驗室,福建福州 350007)

基于金/銀納米三明治結構的表面增強拉曼散射(SERS)特性,實現了前列腺特異性抗原(PSA)高靈敏度免疫檢測,檢測結果具有特異性。采用化學還原法制備金、銀納米粒子,用4-巰基苯甲酸(4-MBA)及前列腺特異性抗體(Anti-PSA)鏈接金、銀納米粒子制備免疫探針,在硅片表面原位生長金、銀納米粒子并鏈接Anti-PSA制備得到免疫基底。將免疫探針、免疫基底以及PSA組成三明治結構,進行基于SERS特性的免疫檢測。實驗結果表明,納米銀免疫探針與納米銀免疫基底組成的三明治結構具有最佳的檢測效果,PSA的檢測靈敏度低至1.8 fg/mL(3.490×10-18mol/L),可應用于前列腺癌癥的早期檢測與診斷。

表面增強拉曼散射;納米免疫探針;納米免疫基底;免疫檢測

1 引 言

目前,癌癥已經嚴重威脅人類的健康,并成為主要死因之一。世界衛生組織(WHO)發布的《世界癌癥報告2014》估計,2030年全世界癌癥死亡人數將達到1 300萬人[1]。同時,世界衛生組織提供的數據也顯示,1/3癌癥患者通過早期發現和早期治療,可以得到根治,如1期的乳腺癌、鼻咽癌和喉癌等5年存活率接近100%[1]。而現在臨床檢測發現的患者往往己經處于癌癥中晚期而無法痊愈,甚至存活期不到1年。因此,開展癌癥的早期診斷技術研究,對于人民健康、社會和諧和經濟持續發展,具有重大意義。

近年來,隨著分子生物學的發展,人們對癌癥病因和病理的認識不斷深化,特別是腫瘤標志物(Tumormarker)的發現,對癌癥的早期診斷、預后和療效評價以及高危人群隨訪等都具有極大的實用價值。另一方面,基于貴金屬納米粒子表面增強拉曼散射(SERS)特性的生物傳感技術,因其具有更高的空間分辨率和靈敏度,可以達到單分子檢測水平,顯示出良好的應用前景[2-6]。基于貴金屬納米粒子SERS特性的腫瘤標志物免疫檢測技術已成為當前的研究熱點[7-10]。

本文應用化學還原法合成出均勻性良好的金、銀納米粒子,然后與拉曼標記分子4-巰基苯甲酸(4-MBA)和前列腺特異性抗體(Anti-PSA)修飾鏈接制備金、銀納米免疫探針,并在硅片表面原位生長金、銀納米粒子層后鏈接Anti-PSA制備納米金或納米銀免疫基底,與前列腺特異性抗原(PSA)組合成為三明治結構,進行基于SERS特性的免疫檢測實驗。結果表明,銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的三明治結構對PSA的檢測濃度低至1.8 fg/mL(3.49×10-18mol/ L),且具有很好的特異性。

2 實 驗

首先由化學還原方法分別合成金、銀納米粒子,然后依次將拉曼標記分子4MBA和Anti-PSA鏈接到納米粒子表面,再用牛血清白蛋白(BSA)包裹裸露的納米粒子表面,即制備得到金、銀納米免疫探針。接下來,將經HF處理過的硅片浸入HAuCl4或AgNO3溶液,待金或銀離子在硅表面還原生成島狀納米膜后,滴加Anti-PSA溶液,即制備得到鏈接Anti-PSA分子的免疫基底。

在免疫檢測過程中,首先將20μL的PSA滴加在制備的免疫基底上,在37℃下置放3 h后,分別用0.05%Tween 20的TPS緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(TBS)緩沖液和去離子水清洗去除未結合的抗原。然后,再滴加20μL免疫探針溶液到基底表面,在4℃下放置2 h后,分別用0.05%Tween 20的TBS緩沖液、TBS緩沖液和去離子水清洗,經氮氣吹干,即形成由免疫基底、抗原和4-MBA標記的免疫探針組成的三明治結構,如圖1所示。

最后,將制備的納米金免疫基底、納米銀免疫基底、PSA和4-MBA標記的金、銀免疫探針分別組合成4種免疫三明治結構用于拉曼光譜測量。

圖1 由金免疫基底、銀納米粒子免疫探針和前列腺特異性抗原組成的免疫三明治結構。Fig.1 Sketch map of the standard sandwich protocol of SERS-based immunoassay

3 結果與討論

3.1 金、銀納米粒子免疫探針的特性

圖2為所合成的金、銀納米粒子的掃描電子顯微鏡(SEM)照片。從圖2可以看出,金納米粒子的平均直徑為(20±5)nm,銀納米粒子的平均直徑為(80±15)nm。金、銀納米粒子和4-MBA標記的金納米免疫探針的紫外-可見吸收光譜如圖3所示,其中曲線1和曲線2以水作為參比溶液,曲線3以磷酸鹽緩沖液作為參比溶液。從圖3(a)可見,所制備的金納米粒子的吸收峰位于520 nm處,其狹窄的半高寬反映出良好的分散性。加入4-MBA后,吸收峰從520 nm紅移到527 nm,說明4-MBA分子成功地鍵合在金納米粒子表面形成S—Au鍵[11];同時,由于金納米粒子的團聚,在673 nm處出現了一個新吸收峰[12-13]。加入anti-PSA后,金納米粒子的吸收峰又分別從527 nm和673 nm紅移至536 nm和684 nm,說明Anti-PSA成功吸附到4-MBA標記的金納米粒子表面。在圖3(b)中,銀納米粒子的最大吸收峰位于409 nm處,狹窄的半高寬同樣反映出良好的分散性。加入4-MBA后,銀納米粒子表面形成S—Ag鍵,吸收峰從409 nm紅移到426 nm,同時峰寬增加,說明4-MBA已與銀納米粒子鍵合并導致銀納米粒子部分團聚。加入Anti-PSA后,吸收峰又從426 nm紅移至438 nm處,表明抗體成功地吸附在4-MBA標記的銀納米粒子表面。圖3(c)是實驗測量中4-MBA溶液和免疫探針中PSA溶液的吸收光譜,從圖中可以看出這2種試劑在可見光范圍內的吸收很小,對總的吸收光譜的貢獻可以忽略,進一步證明圖3(a)和圖3(b)中吸收峰的改變主要是分子與納米粒子鍵合引起的。

圖2 金納米粒子(a)和銀納米粒子(b)的掃描電子顯微鏡照片Fig.2 SEM images of Au NRs(a)and Ag NRs(b)

圖3 (a)金納米粒子(曲線1)、4-MBA標記的金納米粒子(曲線2)和4-MBA標記的金納米免疫探針(曲線3)的吸收光譜;(b)銀納米粒子(曲線1)、4-MBA標記的銀納米粒子(曲線2)和4-MBA標記的銀納米免疫探針(曲線3)的吸收光譜;(c)4-MBA溶液和PSA溶液的吸收光譜。Fig.3 (a)Absorbance spectra of Au NPs(curve 1),4-MBA-labelled Au NPs(curve 2),and 4-MBA-labelled immune nano-Au probes(curve 3),respectively.(b)Absorbance spectra of Ag NPs(curve 1),4-MBA-labelled Ag NPs(curve 2),and 4-MBA-labelled immune nano-Ag probes(curve 3), respectively.(c)Absorbance spectra of 4-MBA solution and PSA solution.

在相同的測量條件下,4-MBA標記的金、銀納米粒子以及對應的免疫探針的SERS光譜如圖4所示。可以看出,4-MBA標記的金、銀納米粒子的SERS信號明顯強于4-MBA標記的金、銀納米粒子免疫探針的SERS信號。正如我們報道過的,上述現象說明抗體修飾納米粒子后并沒有使4-MBA標記的納米粒子進一步團聚,而是增加納米粒子之間的距離使得熱點減少,從而導致拉曼信號減弱[13]。此外,金、銀納米粒子的增強因子(EF)可由公式EF=NbulkISERS/NSERSIbulk計算,式中Nbulk與Ibulk分別代表照射體積內的4-MBA分子數以及拉曼峰的積分強度,NSERS與ISERS代表照射體積內吸附在納米粒子表面的4-MBA分子數以及表面增強拉曼峰的積分強度。由圖4可得Ibulk= 6.1×103,吸附在金、銀納米粒子中4-MBA分子的ISERS分別為1.275 2×105和4.165 15×105。利用拉曼光譜儀的技術參數(激光波長為785 nm,物鏡數值孔徑為0.65,光斑直徑為1.473 μm),以及樣品中10-3mol/L的4-MBA濃度和2.471μm的穿透深度[14],計算出有效激發體積為4.209μm3和NSERS=2.532×106。實驗中,4-MBA粉末的透射深度為2μm,密度為1.5 g·cm-3,摩爾質量為154.19 g·mol-1[15],則可得到Nbulk= 2×1010。經計算,金、銀納米粒子的增強因子分別為1.55×105和3.7×105。可見,銀納米粒子比金納米粒子具有更好的拉曼增強效果。

圖4 (a)4-MBA標記的金納米粒子(曲線1)和4-MBA標記的金納米免疫探針的SERS光譜(曲線2); (b)4-MBA標記的銀納米粒子(曲線1)、4-MBA標記的銀納米免疫探針(曲線2)和干燥4-MBA粉末的SERS光譜(曲線3)。Fig.4 (a)SERSspectra of4-MBA-labelled Au NPs(curve 1),4-MBA-labelled immune nano-Au probes(curve 2).(b)SERS spectra of 4-MBA-labelled Ag NPs (curve 1),4-MBA-labelled immune nano-Ag probes (curve 2),and dry 4-MBA powder(curve 3),respectively.

3.2 納米金基底或納米銀基底的特性

在硅片表面生長的納米金與納米銀島膜的SEM照片如圖5所示。由圖可見,所制備的納米金島膜呈單層結構,由許多小的類“磁疇”的顆粒組成,島與島之間的間隙不大,近乎連續,其“磁疇”的平均直徑為(50±20)nm,孔洞率為10%;而所制備的納米銀島膜是多層結構,其“磁疇”的平均直徑為(80±20)nm,孔洞率為15%。正是因為納米金與納米銀島膜中的類“磁疇”結構,促進了納米金與納米銀島膜表面SERS熱點的產生。

圖5 納米金基底(a)和納米銀基底(b)的SEM照片Fig.5 SEM images of nano-Au(a)and nano-Ag substrate(b)

為了比較納米金基底與納米銀基底的SERS增強效果,我們將兩種基底浸入10-2mol/L的4-MBA乙醇溶液中1 h后,放置在室溫下使其干燥。然后,在兩種基底上分別選取25個點進行4-MBA的SERS光譜測量,結果如圖6所示。由圖6(a)和6(b)可得,與納米金基底與納米銀基底對應的4-MBA的SERS光譜在1 078 cm-1處的平均峰值強度分別為9 400±370(RSD 4.2%)和21 598±1 490(RSD 2.5%)。顯然,納米銀基底比納米金基底有更強的拉曼增強效果。

與前述類似,同樣可以計算納米金和納米銀基底的增強因子。此時,Ibulk=6.1×103,Nbulk= 2×1010,激光輻照光斑面積A=1.704μm2,納米金基底的ISERS=2.04×105,納米銀基底的ISERS= 3.94×105。再根據文獻[16],假設基底的粗糙因子R=1,1 mol的4-MBA分子所占的面積δ=2× 109cm2·mol-1,則由公式NSERS=RA/δ計算得到吸附分子數為5.1×106。最后,計算得到納米金和納米銀基底的拉曼增強因子分別為1.3×105和2.5×105。顯然,納米銀基底的拉曼增強效果優于納米金基底。

圖6 納米銀基底(a)和納米金基底(b)表面的4-MBA分子的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of4-MBA molecules absorbed on nano-Au substrate(a)and nano-Ag substrate(b)

圖7 4種免疫三明治結構下,對應兩種PSA濃度的4-MBA的SERS光譜。(a)金納米免疫探針-PSA-納米金免疫基底; (b)金納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底;(c)銀納米免疫探針-PSA-納米金免疫基底;(d)銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底。Fig.7 SERS spectra of 4-MBA corresponding to two concentrations of PSA.(a)Nano-Au immune probes-PSA-nano-Au immune substrate.(b)Nano-Au immune probes-PSA-nano-Ag immune substrate.(c)Nano-Ag immune probes-PSA-nano-Au immune substrate.(d)Nano-Ag immune probes-PSA-nano-Ag immune substrate.

3.3 前列腺特異性抗原的免疫檢測

將所制備的金、銀免疫探針與納米金免疫基底、納米銀免疫基底、PSA分別組合成4種免疫三明治結構進行拉曼光譜測量。為了比較4種三明治結構的免疫檢測性能,首先檢測兩種濃度PSA的SERS信號,結果如圖7所示。在相同的檢測條件下,銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的三明治結構的檢測效果最佳,而金納米免疫探針-PSA-納米金免疫基底組成的三明治結構的檢測效果較差,其他兩種免疫三明治結構的檢測效果介于這兩者之間。因此,銀納米免疫探針-PSA-銀納米免疫活性基底形成的免疫三明治結構具有更高的檢測靈敏度。

實際上,銀比金有更高的活性,納米銀粒子更容易團聚,將產生較多的熱點,從而導致更強電磁場增強。所以,納米銀探針的SERS信號明顯高于納米金探針的SERS信號。另一方面,根據電荷轉移模型,由于金比銀有更大的功函數(W金=5.1 eV,W銀=4.26 eV),在適當波長激發光的照射下,銀納米粒子表面的電子易于從其費米能級共振躍遷到吸附的4MBA分子最低未占據分子能級上,分子的有效極化率變化較大,因此銀納米粒子的拉曼散射增強較大[17]。此外,根據文獻[18-19],金納米粒子的SERS增強因子先隨粒徑的增大而提高,在60 nm左右時達到極大后又隨著粒徑的增大而降低,而銀納米粒子在80～100 nm之間時SERS強度最大,這與制備探針所用的金納米粒子(平均粒徑(20±5)nm)和銀納米粒子(平均粒徑(80±15)nm)的測量結果一致。同樣地,就基底而言,納米銀基底的多層島膜結構也比納米金基底的單層島膜結構能形成更多的熱點,從而使納米銀基底可以獲得更強的拉曼信號。這些不僅與對金、銀納米免疫探針、納米金免疫基底和納米銀免疫基底的表征結果相一致,也很好地解釋了銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的免疫三明治結構具有高檢測靈敏度的原因。

下面研究銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的免疫三明治結構的檢測靈敏度以及對目標抗原檢測的特異性。首先,配制18 000, 1 800,180,18,1.8 fg/mL的5種抗原濃度的PSA樣本,并檢測對應樣本的拉曼光譜,如圖8(a)所示。再對圖8(a)中各樣本在1 078 cm-1處的峰值強度進行擬合,得到強度與濃度的關系如圖8(b)所示。可以看出,SERS光譜的峰值強度與抗原濃度成正比關系,隨著抗原濃度的降低而減小。考慮到檢測誤差和背景的影響,PSA的最低檢測濃度為1.8 fg/mL。在特異性檢測實驗中,甲胎蛋白(AFP)被用來進行對比實驗,測試結果如圖9所示。由圖可見,與AFP樣本對應的拉曼光譜與無PSA抗原(0 fg/mL)情況下測量的背景光譜幾乎相同,而且在1 078 cm-1的峰值強度遠遠弱于相同濃度下PSA樣本對應的測量結果。因此,銀納米粒子免疫探針-PSA-納米銀免疫基底構成的三明治結構對于PSA具有顯著的檢測特異性。

圖8 (a)對應不同PSA濃度的樣品檢測的4-MBA的SERS光譜;(b)1 078 cm-1處的峰值強度與PSA濃度的擬合曲線。Fig.8 (a)SERS spectra of 4-MBA corresponding to the different concentrations of PSA.(b)Dose-response curve of the peak intensity at1 078 cm-1 changed with the concentration of PSA.

圖9 相同抗原濃度下,與PSA和AFP對應的4-MBA的SERS光譜。Fig.9 SERS spectra of4-MBA for PSA and AFP at the same concentrations

4 結 論

通過制備金、銀納米粒子免疫探針和納米金與納米銀免疫基底,研究了由它們與PSA組成的4種免疫三明治結構的免疫檢測特性。結果表明,以銀納米粒子免疫探針、PSA和納米銀免疫基底組成的免疫三明治結構對PSA具有很高的檢測靈敏度,檢測濃度低至1.8 fg/mL。在相同的測量條件下,對比實驗也表明其對PSA的檢測具有很強的生物特異性。因此,構建的銀納米粒子免疫探針-抗原-納米銀免疫基底的免疫三明治結構對于腫瘤標志物的檢測具有很強的實用性。

[1]Stewart BW,Wild C P.World Cancer Report2014[M].Lyon：IARCNonserial Publication,2014.

[2]Qu G,Zhang G N,Su Y,etal.A label-free and separation-free detection formelamine based on surface enhanced Raman scattering[J].Chin.J.Anal.Chem.(分析化學),2014,42(7)：1022-1027(in Chinese).

[3]Alvarez-Puebla R A,Dos Santos D S,Aroca R F,et al.SERS detection of environmental pollutants in humic acid-gold nanoparticle compositematerials[J].Analyst,2007,132(12)：1210-1214.

[4]Patel B D,Mehta P J.An overview：Application of Raman spectroscopy in pharmaceutical field[J].Curr.Pharm. Anal.,2010,6(2)：131-141.

[5]Zheng L,Zhao Y P.Identification of Pu'er teas with different fermentation time by surface-enhanced Raman scattering technology[J].Chin.J.Lumin.(發光學報),2013,34(2)：230-234(in Chinese).

[6]Han X X,Zhao B,Ozaki Y.Label-free detection in biological applications of surface-enhanced Raman scattering[J]. TrAC-Trend.Anal.Chem.,2012,38(9)：67-78.

[7]Yuan R H,Liu W H,Teng Y J,et al.Detection of ethoprophos using SERS coupled withmagnetic Fe3O4/Ag composite materials[J].Spectrosc.Spect.Anal.(光譜學與光譜分析),2015,35(5)：1276-1280(in Chinese).

[8]Han X X,Zhao B,Ozaki Y.Label-free highly sensitive detection of proteins in aqueous solutions using surface-enhanced Raman scattering[J].Anal.Chem.,2009,81(9)：3329-3333.

[9]Xu SP,Ji X H,Xu W Q,et al.Immunoassay using probe-labelling immunogold nanoparticles with silver staining enhancement viasurface-enhanced Raman scattering[J].Analyst,2004,129(1)：63-68.

[10]Wu L,Wang Z Y,Zong SF,et al.A SERS-based immunoassay with highly increased sensitivity using gold/silver coreshell nanorods[J].Biosens.Bioelectron.,2012,38(1)：94-99.

[11]Cui Y,Ren B,Yao JL,etal.Multianalyte immunoassay based on surface-enhanced Raman spectroscopy[J].J.Raman Spectrosc.,2007,38(7)：896-902.

[12]Song C Y,Wang ZY,Zhang R H,etal.Highly sensitive immunoassay based on Raman reporter-labeled immuno-Au aggregates and SERS-active immune substrate[J].Biosens.Bioelectron.,2009,25(4)：826-831.

[13]Shu L,Zhou J,Yuan X C,etal.Highly sensitive immunoassay based on SERSusing nano-Au immune probes and a nano-Ag immune substrate[J].Talanta,2014,123(9)：161-168.

[14]Alvarez-Puebla R A.Effects of the excitation wavelength on the SERS spectrum[J].J.Phys.Chem.Lett.,2012,7 (3)：857-866.

[15]Xia JR,Wei R,Wu Y M,et al.Synthesis of large flower-like substrates for surface-enhanced Raman scattering[J]. Chem.Eng.J.,2014,244(10)：252-257.

[16]Wang A J,Lv JJ,Zhou D L,etal.Facile synthesis of ultrathin worm-like Au nanowires for highly active SERSsubstrates [J].New J.Chem.,2014,38(8)：3395-3400.

[17]Adrian F J.Charge transfer effects in surface-enhanced Raman scattering[J].J.Chem.Phys.,1982,77(11)：5302-5314.

[18]Zeman E J,Schatz G C.An accurate electromagnetic theory study of surface enhancement factors for silver,gold,copper, lithium,sodium,aluminum,gallium,indium,zinc,and cadmium[J].J.Phys.Chem.,1987,91(3)：634-643.

[19]Emory SR,Nie S.Screening and enrichment ofmetal nanoparticles with novel optical properties[J].J.Phys.Chem. B,1998,102(3)：493-497.

封昭(1990-),男,陜西咸陽人,碩士研究生,2013年于寶雞文理學院獲得學士學位,主要從事表面增強拉曼散射及其應用的研究。

E-mail：fengzhaozj@163.com

周駿(1958-),男,安徽當涂人,博士,教授,1996年于上海交通大學獲得博士學位,主要從事納米功能材料、光電子技術和生物光子學等方面的研究。

E-mail：yzhoujun@nbu.edu.cn

Hypersensitization Immunoassay of Prostate-specific Antigen Based on SERS of Sandw ich-type Au/Ag Nanostructure

FENG Zhao1,ZHOU Jun1*,CHEN Dong1,WANG Shao-min2,WANG Xiao-jun2,XIE Shu-sen3

(1.Department ofMicroelectronic Science and Engineering,Faculty of Science,Ningbo University,Ningbo 315211,China; 2.Affiliated Hospital ofSchool ofMedicine,Ningbo University,Ningbo 315020,China; 3.Key Laboratory ofOptoElectronic Science and Technology forMedicine ofMinistry of Education, Fujian Provincial Key Laboratory for Photonics Technology,Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China) *Corresponding Author,E-mail：zhoujun@nbu.cn

Based on surface enhanced Raman scattering(SERS),a super-sensitive immunoassay of prostate specific antigen(PSA)was developed with the sandwich-type structure consisted of the nano-Ag immune probes and nano-Ag immune substrate.Experimentally,the chemical reductionmethod was used to prepare Au and Ag nanoparticles,the nano-Au/Ag immune probeswere prepared by immobilising Raman reportermolecule4-mercaptobenzoic acid(4-MBA)and anti-prostate specific antigen antibody(Anti-PSA)onto the surfaces of Au/Ag nanoparticles.The nano-Ag/Au immune substrateswere prepared by in-situ growing of Ag/Au nanoparticles on a silicon wafer and linkingwith Anti-PSA.The immunoassays of PSA were explored by the four kinds of sandwich-type structures consisted of the nano-Au/Ag immune probes and nano-Au/Ag immune substrates,respectively.It is found that the sandwich-type structure consisted of nano-Ag immune probe and nano-Ag immune substrate is the bestone to the immunoassay of PSA,and the detection limitof PSA is as low as1.8 fg/mL(3.490×10-18mol/L),which is suitable to be applied in early detection and diagnosis of prostate cancer.

surface-enhanced Raman scattering;nano-immune probe;nano-immune substrate;immunoassay

O433.1

A

10.3788/fgxb20153609.1064

1000-7032(2015)09-1064-07

2015-05-11;

2015-08-09

國家自然科學基金(61275153,61335011,61320106014);浙江省自然科學基金(LY12A04002);寧波大學王寬誠幸福基金資助項目