超聲波預處理葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董聰，李芳，王琳，羅豐收，朱俊雅，孔令明，*（.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊83005；.新疆輕工職業技術學院，新疆烏魯木齊8300）

超聲波預處理葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董聰1，李芳2，王琳1，羅豐收1，朱俊雅1，孔令明1，*
（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆輕工職業技術學院，新疆烏魯木齊830021）

摘要：以葵花籽粕蛋白粉為原料，利用超聲波對其進行預處理，采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶為酶制劑對葵花籽粕蛋白進行酶解，以抗氧化性為指標，通過單因素及響應面法對預處理條件進行優化，獲取最佳預處理工藝。結果表明，葵花籽粕蛋白質的超聲波最佳預處理工藝為：超聲波時間25 min、超聲波功率187.5 W、超聲波溫度40℃。在此條件下，葵花籽粕多肽對超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）清除能力分別為67.11%和52.47%。

關鍵詞：超聲波預處理；葵花籽粕蛋白；多肽；抗氧化活性

新疆地處歐亞大陸中部，光照資源豐富，干旱少雨，晝夜溫差大，適宜向日葵的生長同時是向日葵的主產區，目前全疆每年向日葵的種植面積在10萬畝左右，年產葵花籽25.39萬t[1]。

葵花籽粕是葵花籽制油的副產物，葵花籽粕營養物質豐富，含29%～43%的優質的植物蛋白[2]，且氨基酸組成均衡。葵花籽粕中還含有大量的類脂、碳水化合物、還原糖、灰分[3]及大量的鈣、磷和煙酸[4]等。

葵花籽粕蛋白質具有很好的蛋白特性，經過適當酶解可制備生物活性多肽如抗氧化劑、ACE抑制劑、抗疲勞劑抗癌劑及抗菌劑等[5]，已有的研究表明，葵花籽粕多肽具有較高的抗氧化劑抗高血壓活性[6]。抗氧化活性肽因具有較強的抗氧化活性和很高的安全性，故可作為具有抗氧化作用的食品添加劑或直接作為保健食品應用于食品工業[7]。但目前，葵花籽加工僅限于榨油和制作炒貨食品，而葵花籽粕多用作牲畜飼料或者直接拋棄，這不僅造成了極大的資源浪費而且還污染環境，對于其的精深加工后的經濟價值值得人們重視。

超聲波具有空化作用，可以在瞬間產生較強的機械剪切力，使蛋白質構象改變，促使其親水基團暴露出來的更多[8]，有利于蛋白質底物和酶結合，提高酶解效率。本研究對超聲波預處理雙酶酶解葵花籽粕蛋白制備抗氧化活性多肽工藝進行優化，從而提高葵花籽粕利用率及創造更高的經濟價值。研究成果將為葵花籽綜合利用及開發功能性食品提供科學數據和參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葵花籽粕蛋白：新疆農業大學食藥學院實驗室自制；堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶：購于南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇、鄰菲羅啉、鄰苯三酚：購于天津市化學試劑三廠；氫氧化鈉：購于天津市福星化學試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫30%，等：購于天津市光復科技發展有限公司。

1.2儀器與設備

全數字超聲波發生器：武漢嘉鵬電子有限公司（額定功率250 W）；電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；雷磁PHS-3C：上海儀電科學儀器股份有限公司；AL204-1C型電子天平：上海梅特勒托利多儀器有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3試驗方法

1.3.1超聲波輔助酶解葵花籽粕蛋白工藝流程

葵花籽粕蛋白→懸浮液→超聲波預處理→調pH→水浴酶解→滅酶→離心→取上清液→測定抗氧化能力

1.3.2抗氧化能力的測定

·OH清除能力的測定：采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[9]；O2-·清除能力的測定：采用鄰苯三酚方法[6]。

1.3.3單因素試驗

選用堿性蛋白酶（酶活力為2.265×10-3kat/g）及木瓜蛋白酶（酶活力1.674×10-3kat/g）為酶制劑，在時間為190 min、pH為7.6、復合酶（堿性蛋白酶：木瓜蛋白酶）比例為2.5∶1（質量比）、[E]/[S]為2%、底物濃度為2%、溫度為50℃的酶解條件下，以抗氧化能力為指標，確定超聲波預處理葵花籽粕蛋白的最佳功率[10]、溫度[11]、時間[12]條件。

1.3.4響應面優化試驗

在超聲波功率（X1）、超聲波時間（X2）、超聲波溫度（X3）單因素試驗的基礎上，以羥基自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率為指標，以超聲波功率、超聲波時間、超聲波溫度為試驗因素，進行三因素三水平響應面試驗，對超聲波輔助復合酶解工藝進行優化。因素水平表如表1所示。

表1　試驗因素水平表Table 1　Test factor and level table

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果與分析

2.1.1超聲波預處理功率對葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響

在超聲波溫度為40℃、超聲波時間為20 min、超聲波功率分別為0、62.5、125、187.5、250 W的條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如圖1所示。

由圖可知超聲波功率在0%～75%范圍內時，抗氧化能力隨超聲波功率的增加而增大，在超聲波功率為187.5 W時，超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力均達到最大值，分別為57.71%和39.38%。超聲波功率大于187.5 W后，抗氧化能力并沒有隨功率的增加而增大，可能是因為功率較大致使蛋白質變性，故確定超聲波功率為187.5 W。

2.1.2超聲波預處理溫度對葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響

在超聲波時間為20 min、超聲波功率為125 W、超聲波溫度分別為30、35、40、45、50℃的條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如圖2所示。

由圖2可知超聲波功溫度在30℃～40℃范圍內時，抗氧化能力隨超聲波溫度的增加而增大，在超聲波溫度為40℃時，超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力均達到最大值，分別為61.63%和44.67%。超聲波溫度高于40℃后，抗氧化能力隨超聲波溫度的增加而呈現下降趨勢，說明超聲波輔助酶解的溫度不一定和水浴酶解的溫度一致，故確定超聲波溫度為40℃。

2.1.3超聲波預處理時間對葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響

圖2　超聲波溫度對抗氧化能力的影響Fig.2　Ultrasonic temperature effects the anti-oxidation

在超聲波功率為125 W、超聲波溫度為40℃、超聲波時間分別為10、15、20、25、30 min的條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如圖3所示。

圖3　超聲波時間對抗氧化能力的影響Fig.3　Ultrasonic time effects the anti-oxidation

由上圖可知超聲波功時間在10 min～25 min范圍內時，抗氧化能力隨超聲波時間的增加而逐漸增大，在超聲波時間達到25 min時，超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力均達到最大值，分別為58.07%和35.62%。超聲波時間大于25 min后，抗氧化能力隨超聲波時間的增加而逐漸下降，可能是由于經過超聲波的輔助水解使葵花籽粕蛋白質高度壓縮、緊密的結構斷開，長鏈打開，故抗氧化能力在較短時間內呈現升高的趨勢，由此確定超聲波時間為25 min。

2.2響應面試驗結果與分析

根據上述單因素試驗結果，利用Design Expert8.0軟件進行響應面優化試驗，如表2。

以超聲波功率、時間、溫度為響應變量，以超氧陰離子自由基清除率為響應值對表2進行方差分析，模型顯著性及數據結果見表3。

表2　根據Design-erpert8.0設計響應面試驗方案及結果Table 2　The test scheme and results according to design-erpery 8.0 design response surface

表3　模型方差分析及模型系數顯著性檢驗Table 3　Model significant inspection and regression model analysis of variance

以超聲波功率、時間、溫度為響應變量，以羥基自由基清除率為響應值對表2進行方差分析，模型顯著性及數據結果見表4。

表4　模型方差分析及模型系數顯著性檢驗Table 4　Model significant inspection and regression model analysis of variance

利用Design-erpert8.0對結果進行回歸分析，以超聲波時間、超聲波功率、超聲波溫度為響應變量，以超氧陰離子自由基清除率（Y1）和羥基自由基的清除率（Y2）為響應值的回歸方程為：

由表3回歸方差分析可知，模型R2=0.998 6說明回歸方程有意義，F模型=496.08（P<0.000 1），模型極顯著，失擬項F=0.020（P<0.05）結果不顯著；由表4回歸方差分析可知，模型R2=0.999 4說明回歸方程有意義，F模型=1 853.55（P<0.000 1），模型極顯著，失擬項F= 0.92（P<0.05）結果不顯著，表3和表4說明試驗結果誤差較小擬合度較小，能較好的反應試驗結果。

通過軟件分析結果得出，葵花籽粕多肽對自由基清除率最佳條件為：超聲波時間25 min、超聲波功率187.5 W、超聲波溫度40℃。在此條件下，葵花籽粕多肽對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率分別為67.11%和52.47%。響應面優化結果見圖4～圖7。

圖4　時間和溫度對O·清除率影響的響應面圖Fig.4　Response surface of time and temperature on the scavenging capacity of O·

圖5　功率和溫度對O·清除率影響的響應面圖Fig.5　Response surface of power and temperature on the scavenging capacity of O·

圖6　時間和功率對·OH清除率影響的響應面圖Fig.6　Response surface of time and power on the scavenging capacity of·OH

圖7　功率和溫度對·OH清除率影響的響應面圖Fig.7　Response surface of power and temperature on the scavenging capacity of·OH

3　結論

本文采用超聲波預處理葵花籽粕蛋白后，再對其進行酶解得到葵花籽粕抗氧化活性多肽。比較葵花籽粕多肽對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率，確定其最佳預處理條件。在單因素試驗的基礎上，通過響應曲面法獲得最優預處理工藝為：超聲波時間25 min、超聲波功率187.5 W、超聲波溫度40℃。在此條件下，葵花籽粕多肽液對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率分別為67.11%和52.47%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.003

收稿日期：2014-07-24

基金項目：自治區科技支疆項目“葵花籽粕功能多肽高效制備技術研究與產品開發”（2013911070）

作者簡介：董聰（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農產品加工及綜合利用。

*通信作者：孔令明（1976—），男（漢），副教授，碩士生導師，研究方向：農產品加工及綜合利用研究。

Ultrasonic Pretreat Protein of Sunflower Meal Preparation Antioxidant Peptides

DONG Cong1，LI Fang2，WANG Lin1，LUO Feng-shou1，ZHU Jun-ya1，KONG Ling-ming1，*
（1.College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China）

Abstract：Sunflower meal protein powder used as raw material，used ultrasonic to pretreated it，made alkaline protease and papain as enzyme preparation on sunflower meal protein hydrolysis.Optimized pretreatm process conditions by univariate and response surface method with antioxidant activity as an index，to obtain the best pretreatment processes.The results showed that the best sunflower meal protein ultrasonic pretreatment process：ultrasonic time 25 min，ultrasonic power187.5 W，ultrasonic temperature of 40℃.Under this condition，the scavenging of sunflower meal peptides on superoxide anion radical（O2-·）and hydroxyl radicals（·OH）were 67.11%and 52.47%.

Key words：ultrasonic pretreat；sunflower meal protein；peptides；antioxidant activity