基于譜效關系的α-糖苷酶抑制劑篩選方法研究

王利強，常春艷，婁婷婷，葛含光，王永芳，葛寶坤（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

基于譜效關系的α-糖苷酶抑制劑篩選方法研究

王利強，常春艷，婁婷婷，葛含光，王永芳，葛寶坤
（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

摘要：采用以生物活性色譜為基礎的譜效篩選模式，以減肥茶為研究對象，首先確認了該減肥茶對α-糖苷酶有較強的抑制活性；進一步建立了α-糖苷酶抑制劑篩選模型，并與液相色譜串聯質譜相結合，對減肥茶進行譜效關系分析，從中篩選到7個對α-糖苷酶有較強的抑制活性的化合物，通過質譜進行結構鑒定。這7個化合物分別為兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素；最后對這7個化合物進行活性驗證。建立的基于譜效關系分析對α-糖苷酶抑制劑的篩選和鑒定的方法簡單、快速、準確率高。可用于對天然產物等復雜體系中活性物質的快速篩選和鑒定。

關鍵詞：譜效關系；篩選體系；α-糖苷酶抑制劑；減肥茶

天然產物資源具有巨大的經濟價值和應用價值，許多天然產物中含有活性功能的化合物。對天然產物活性成分的研究也是功能食品研究的重點[1-2]。而針對成分復雜的天然產物，建立一種快速高效的篩選和鑒定體系是提高天然產物研究效率的關鍵問題。譜效關系研究是近年來興起的將指紋圖譜與藥效研究相結合的一種研究方法，常用于天然產物中活性成分靶向性篩選[3]。生物活性色譜技術是研究譜效關系重要方法，生物活性色譜將天然產物的成分分離、鑒定和藥效活性評價等步驟在一個體系中完成。相對于傳統方法，生物活性色譜可以極大提高活性物質篩選的速度和效率，降低傳統天然產物活性成分開發的成本[4-5]。

α-糖苷酶是人體內將淀粉逐級水解和消化，最終轉化為葡萄糖為人體提供能量的關鍵酶。研究表明，抑制α-糖苷酶的活性，降低淀粉的消化吸收速率是一種有效的控制體重和減肥的手段之一[6]。因此，以α-糖苷酶為作用靶點，篩選有效的α-糖苷酶抑制劑也成為減肥藥物研發的重要方向之一[7]。天然產物種類繁多，資源豐富，經過幾千年的時間和發展，也驗證了一些有良好療效的產物，在治療肥胖癥和減肥方面有很大的優勢，如荷葉、蓮子、桑枝、黃連、大黃等[8-10]。市售某品牌減肥茶由荷葉、決明子、烏龍茶、澤瀉、苦丁茶、大黃、陳皮等七味中藥為主要原料制成保健食品。經試驗證明，具有減肥功能，受到市場的認可。但是該配方成分復雜，目前對其中的活性成分的研究并不全面，僅以槲皮素作為質量控制的指標成分。因此，需要全面對該產品中的活性成分進行分析和評價，可以更有效地進行產品質量控制和藥理研究。

本研究采用以生物活性色譜為基礎的譜效篩選模式，以該減肥茶為研究對象，首先從整體水平評價其對α-糖苷酶的抑制活性，進一步采用基于活性的液質聯用篩選模型進行譜效關系分析，并鑒定其中有α-糖苷酶抑制活性的成分，最后對篩選到的活性成分進行活性驗證。

1　試驗部分

1.1試劑與儀器

市售某品牌減肥茶：中國；阿卡波糖：美國Sigma公司；人源α-糖苷酶：南開大學藥學院提供；葡萄糖測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司；甲醇、乙腈：美國Thermo-Fisher公司；其他試劑均為國產分析純。

Q-Exactive質譜儀：美國Thermo-Fisher公司；Model 680酶標儀：美國，Bio-Rad；十萬分之一電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；高速離心機：德國Sigma公司；KQ3200型超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1樣品制備

稱取1.0 g減肥茶于試管中，加入10 mL100℃熱水浸泡30 min，后經高速離心機8000 r/min離心10 min，取上清液待用。

1.2.2整體α-糖苷酶抑制活性評價

減肥茶對α-糖苷酶的抑制活性是通過對α-糖苷酶與底物麥芽糖的反應速度的影響來測定。在96孔板中加入10 μL 10倍系列稀釋的樣品溶液或者陽性藥，加入100 μL 0.1%的麥芽糖溶液作為底物，在37℃的恒溫培養箱中孵育5 min后，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液啟動反應，37℃的恒溫培養箱中反應30 min，加入20 μL 1 mol/L的HCl終止反應。然后用葡萄糖氧化酶法測定反應中產生的葡萄糖的含量。取40 μL上述的反應液，向其中加入150 μL的葡萄糖工作液。37℃的恒溫培養箱中反應15 min后，用酶標儀在490 nm條件下測定其吸光度值。通過統計軟件Graphpad Prism 5的非線性回歸方法來計算相應樣品的IC50值，即抑制率達到50%時的抑制劑的濃度。

1.2.3譜效關系分析

取樣品提取液（0.5 g/mL）用Q-Exactive液相色譜質譜儀進行活性成分的分離和結構鑒定。液相條件：Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；二元梯度洗脫：0～15 min 5%～40%B，15 min～30 min 40%～100%B，30min～35 min100%B。流速為0.3mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。樣品溶液通過以上液相條件進行分離，分離后用96深孔板進行液相餾分的收集，每30 s收集到一個孔內。收集后的餾分在50℃的條件下減壓干燥，剩余的物質用100 μL的0.1%的麥芽糖溶液充分溶解，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液，37℃的恒溫培養箱中反應30 min，加入20 μL 1 mol/L 的HCl終止反應。然后用葡萄糖氧化酶法測定反應中產生的葡萄糖的含量，方法同1.2.2。之后對活性成分進行質譜分析。質譜條件：電噴霧（ESI）離子源，正離子檢測模式。掃描范圍：m/z 100～1 500；分辨率：70 000；毛細管電壓為3 kV；二級質譜碰撞能20 V。

1.2.4活性成分活性驗證

根據譜效關系篩選到的活性物質，配制10倍系列稀釋標準樣品溶液。在96孔板中加入10 μL 10倍系列稀釋的單體物質溶液，加入100 μL 0.1%的麥芽糖溶液作為底物，在37℃的恒溫培養箱中孵育5 min后，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液啟動反應，37℃的恒溫培養箱中反應30 min，加入20 μL 1 mol/L的HCl終止反應。然后用葡萄糖氧化酶法測定反應中產生的葡萄糖的含量。通過統計軟件Graphpad Prism 5的非線性回歸方法來計算相應樣品的IC50值。

2　結果與討論

2.1整體α-糖苷酶抑制活性評價

針對減肥茶進行α-糖苷酶抑制劑的篩選，考慮到該減肥茶的日常使用方法是熱水浸泡后引用，因此，為了更加接近實際，選用熱水浸泡方式進行提取。目前，市售的α-糖苷酶主要是從酵母、鼠和豬體內提取得到，為了使活性評價結果更為準確，選取南開大學藥學院實驗室成功表達的人源α-糖苷酶。樣品對α-糖苷酶的抑制曲線見圖1。

由圖1可知，減肥茶溶液對α-糖苷酶抑制的IC50值為15.19 mg/mL，而陽性藥阿卡波糖對α-糖苷酶抑制的IC50值1.112 μg/mL，即15.19 mg/mL的減肥茶提取液就能達到與阿卡波糖1.112 μg/mL相當的抑制效果。考慮到阿卡波糖對α-糖苷酶有極強的抑制作用，因此該減肥茶提取液對α-糖苷酶有較強的抑制作用，該減肥茶中含有α-糖苷酶抑制劑成分，可以對減肥茶中的活性成分進行進一步的篩選和鑒定。

圖1　減肥茶提取物和阿卡波糖對α-糖苷酶的抑制曲線Fig.1　Inhibition curve of the extract of slimming tea and acarbose against α-glucosidase

2.2譜效關系分析

減肥茶提取溶液經液相分離后，通過三通分流器分流，90%洗脫液收集于96孔板中用于α-糖苷酶抑制活性檢測，其余10%進入質譜用于結構鑒定分析。其正離子模式總離子流圖分別如圖2A所示。按0.5 min/孔收集減肥茶提取溶液的UPLC流出液，共收集60段，測定每份流出液對α-糖苷酶的抑制活性，結果見圖2B，其中的7段樣品具有顯著的α-糖苷酶的抑制活性，以1、2、3、4、5、6、7表示。通過Q-Exactive質譜對以上7段具有顯著性NF-κB抑制活性的物質進行結構鑒定，其一級質譜及二級質譜信息見表1。

圖2　減肥茶提取物的總離子流圖和α-糖苷酶抑制活性圖Fig.2　The TIC chromatography of extract of Slimming Tea and bioactivity chromatograms of α-glucosidase inhibition activity

由一級質譜（MS）測定可以得到物質的精確分子量信息，通過這些物質的精確分子量比對相關的文獻報道及化合物庫，推測各個物質的分子式，再根據二級質譜（MS/MS）中的碎片信息（表1），并結合每個單味藥材中已報道的成分結構信息，推測物質可能的結構式。按照上述方法進行化合物結構解析，該減肥茶提取溶液篩選到的7個α-糖苷酶抑制劑分別是兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素。

表1　減肥茶中α-糖苷酶抑制劑的鑒定結果Table 1　MS/MS data and the identification results for the bioactive compounds in slimming tea

2.3活性成分活性驗證

根據譜效關系分析，篩選到了兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素7種可能的α-糖苷酶抑制劑。考慮到譜效分析中對化合物的活性測定都是在單一濃度條件下進行的，可能會有一定的假陽性幾率。因此，進一步測定這些化合物對α-糖苷酶的抑制曲線，通過對α-糖苷酶抑制的IC50值對其抑制活性進行評價。結果顯示見圖3。

由圖3可知，槲皮素的IC50為2.40 μg/mL，荷葉堿的IC50為3.43 μg/mL，兒茶素的IC50為4.47 μg/mL，2-羥基-1-甲氧基阿樸啡的IC50為18.85 μg/mL，兒茶素沒食子酸脂的IC50為24.08 μg/mL，大黃素的IC50為37.55 μg/mL，蘆丁的IC50為253.8 μg/mL。表明7種化合物對α-糖苷酶都有一定的抑制作用，槲皮素，荷葉堿和兒茶素對α-糖苷酶的抑制作用與陽性藥物強α-糖苷酶抑制劑阿卡波糖的IC50（1.112 μg/mL）屬于同一水平，也屬于強α-糖苷酶抑制劑，2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、兒茶素沒食子酸脂、大黃素對α-糖苷酶的抑制作用次之，蘆丁的抑制作用較弱。文獻研究表明：槲皮素、荷葉堿、蘆丁和2-羥基-1-甲氧基阿樸啡主要來源于減肥茶中荷葉[11]，兒茶素，兒茶素沒食子酸酯主要來源于烏龍茶，苦丁茶和荷葉[12-13]，大黃素主要來源于決明子和大黃[14-15]。表明這幾味藥材是該減肥茶中α-糖苷酶抑制劑的主要來源，而該減肥茶配方中多數配料含有α-糖苷酶抑制劑，也說明表明抑制α-糖苷酶的活性，減少淀粉等碳水化合物的代謝也是該減肥茶的一個主要的作用機理。本研究建立的譜效篩選體系對α-糖苷酶抑制劑的篩選和鑒定的方法簡單、快速、準確率高。本方法可以較好解決以往中藥等復雜成分中活性成分篩選中需要藥材量大，操作繁瑣的問題。對于難以分離和含量較少的化合物也可實現高效篩選和鑒定。

圖3　7種化合物對α-糖苷酶的抑制曲線Fig.3　Inhibition curve of the extract of seven compounds注：濃度單位為μg/mL。

3　結論

本研究采用以生物活性色譜為基礎的譜效篩選模式，以市售某品牌減肥茶為研究對象，首先在整體水平上確認該減肥茶對α-糖苷酶有較強的抑制活性；進一步建立針對微量樣品的α-糖苷酶抑制劑篩選模型，并與液相色譜串聯質譜相結合，對該減肥茶進行譜效關系分析，從中篩選到7個對α-糖苷酶有較強的抑制活性的化合物，通過質譜進行結構鑒定，這7種化合物分別為：兒茶素、兒茶素沒食子酸脂、蘆丁、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、槲皮素、荷葉堿和大黃素；最后對這7種化合物進行活性驗證。本研究建立的譜效篩選體系對α-糖苷酶抑制劑的篩選和鑒定的方法簡單、快速、準確率高。可用于對天然產物等復雜體系中活性物質的快速篩選和鑒定。

參考文獻：

[1]Kumar K S,Anuradha S,Sarma G R,et al.Screening,isolation,taxonomy and fermentation of an antibiotic producer Streptomyces xinghaiensis from soil capable of acting against linezolid resistant strains[J].IndianJournalofExperimental Biology,2012,50(10):718-728

[2]杜冠華,劉艾林,張莉,等.天然產物中先導化合物的快速發現技術[J].中國天然藥物,2005,3(6):328-331

[3]陶金華,狄留慶,文紅梅,等.中藥指紋圖譜譜效相關性研究思路探討[J].中國中藥雜志,2009,34(18):2410-2413

[4]Wang L,Cui Q,Hou Y,et al.An integrated strategy of ultra-highperformance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry and virtual screening for the identification of αglucosidase inhibitors in acarviostatin-containing complex[J].Journal of Chromatography A,2013,1319(12):88-96

[5]Cheng B,Hou Y,Wang L,et al.Dual-bioactivity-based liquid chromatography-coupled quadrupole time-of-flight mass spectrometry for NF-κB inhibitors and β2AR agonists identification in Chinese Medicinal Preparation Qingfei Xiaoyan Wan[J].Analytical& Bioanalytical Chemistry,2012,404(8):2445-2452

[6]Eskandari R,Jones K,Reddy K R,et al.Probing the Intestinal alpha-Glucosidase Enzyme Specificities of Starch-Digesting Maltase-Glucoamylase and Sucrase-Isomaltase:Synthesis and Inhibitory Properties of 3'-and 5'-Maltose-Extended De-O-sulfonated Ponkoranol[J].Chemistry-AEuropeanJournal,2011,17(52): 14817-14825

[7]Sim L,Jayakanthan K,Mohan S,et al.New Glucosidase Inhibitors from an Ayurvedic Herbal Treatment for Type 2 Diabetes:Structures and Inhibition of Human Intestinal Maltase-Glucoamylase with Compounds from Salacia reticulata[J].Biochemistry,2009,49(3): 443-451

[8]孫晨光.論荷葉的減肥降脂作用[J].中醫臨床研究,2014,6(3): 100-102

[9]楊冬,劉舒,宋鳳瑞,等.虎杖和大黃中α-葡葡萄糖苷酶抑制劑的超濾質譜研究[J].分析化學,2014,42(4):552-558

[10]劉超,史正琴,向偉,等.桑枝1-脫氧野尻霉素的提取及其含量與α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關性分析[J].林業科學,2015,51(2): 112-120

[11]周健鵬.荷葉化學成分和藥理作用研究進展[J].天津藥學,2014, 26(2):65-68

[12]王存琴,張艷華.大葉冬青的化學成分及藥理活性研究進展[J].中國藥房,2014,25(11):1052-1054

[13]耿鵬,石倩,楊洋,等.桑白皮生物堿與綠茶茶多酚的聯合降糖作用[J].南開大學學報(自然科學版),2011(3):76-79

[14]張偉,彭濤,尹震花,等.決明子生品與炮制品對α-葡萄糖苷酶抑制活性[J].醫藥導報,2013,32(11):1410-1413

[15]傅興圣,陳菲,劉訓紅,等.大黃化學成分與藥理作用研究新進展[J].中國新藥雜志,2011(16):1534-1538

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.008

收稿日期：2015-09-01

基金項目:天津出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（TK078-2013）

作者簡介：王利強（1984—），男（漢），工程師，博士，研究方向：食品檢測。

Study on Screening of the Effective Components for Inhibition α-Glucosidase Based on Chromatography-efficacy Relationship

WANG Li-qiang，CHANG Chun-yan，LOU Ting-ting，GE Han-guang，WANG Yong-fang，GE Bao-kun
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：The chromatography-efficacy relationship screening based bioactive chromatography was used for the research on slimming tea.The inhibition activity of the slimming tea against α-glucosidase was validated firstly.Then the α-glucosidase inhibitor screening method combined with HPLC-MS/MS system was established for the chromatography-efficacy relationship of slimming tea，seven compounds with α-glucosidase inhibition activity were obtained.The compounds structure were characterized as：catechin，catechingallate，rutin，2-hydroxy-1-methoxyaporphine，quercetin，nuciferin and emodin.The α-glucosidase inhibition activity of these compounds were comfirmed.The method for α-glucosidase inhibitor screening and identification based chromatography-efficacy relationship was simple，fast and with high accuracy.It can be used for the bioactivie compounds screening and identification in the complicated natral product.

Key words：chromatography-efficacy relationship；screening system；α-glucosidase；slimming tea