魚肉蛋白質凝膠結構的保水機制研究

駱盧佳，陳凌，小川廣男（.嘉興職業技術學院農業與環境分院，浙江嘉興34036；.東京海洋大學食品科學與技術學院，東京港區08-8477）

魚肉蛋白質凝膠結構的保水機制研究

駱盧佳1，陳凌1，小川廣男2
（1.嘉興職業技術學院農業與環境分院，浙江嘉興314036；2.東京海洋大學食品科學與技術學院，東京港區108-8477）

摘要：研究肌動球蛋白和肌球蛋白凝膠的結構以闡明魚肉凝膠網狀結構的保水機制。隨著水分含量的增加，不管何種鹽濃度條件下，在肌動球蛋白及肌球蛋白凝膠中，架橋點間平均分子量有所增加，相關長也呈現增加的趨勢。當水分含量繼續增加時，凝膠中的相關長開始減小。從掃描電子顯微鏡的結果中也可以看到類似的現象。此結果表明，在特定的水分含量中，不僅僅是構成凝膠結構的蛋白質分子鏈在伸長，同時預示著蛋白質分子鏈也有所開裂。

關鍵詞：肌原纖維蛋白質；架橋；分子量；相關長

凝膠是指在分散介質中的膠體粒子或高分子溶質形成整體構造而失去了流動性，或膠體雖含有大量液體介質但處于固化的狀態，是食品中一種較為常見的形態[1]。作為魚肉主要成分的蛋白質，其最重要的功能特性之一就是凝膠化作用。而有關魚肉蛋白質凝膠的研究，早在1939年就有人對凝膠的形成機制作了報道，另外從各種魚肉凝膠的形成能[2-3]、蛋白質結構[4]、凝膠強度[5]等角度也展開了大量的研究。但是從魚肉蛋白質凝膠中的水分著手的研究卻寥寥無幾。其中針對凝膠中水的存在狀態有過除自由水外，同時存在結合能力不同的別種水的說法，后來利用壓出法，吸出法等的測定，確認了3種不同存在狀態的水[6]，并且隨著溫度的上升結合水有向游離水轉變的趨勢[7]。另外還利用了有關魚肉肌原纖維蛋白質的水分吸附等溫線[8]以及NMR觀測了魚肉蛋白質凝膠中水的狀態[9]，近年來利用低場核磁共振（LF-NMR）法研究凝膠中的水分分布[10-11]也有被報道，因此有關凝膠中的水的解釋以及肽鏈與水分子間的相互作用力，上述的研究都做了詳細的介紹，但是魚肉蛋白質凝膠是形成了怎樣的結構來保持住水分的機制并不明確。

對于魚肉蛋白質凝膠的結構解析之前曾利用橡膠彈性理論，但是用溫度記錄儀測定魚肉蛋白質凝膠拉升時所產生的熱時，溫度在拉升過程中并沒有上升；由應力緩和測定發現，魚肉蛋白質凝膠隨著溫度的上升彈性率下降[12]，這一系列的試驗表明其與橡膠的性質相反。那是由于魚肉蛋白質凝膠中含有比較多的與凝膠形成無關的物質，這些蛋白質凝集物對壓縮進行抵抗，彈性率的變化就顯示出與橡膠相反的行為，利用橡膠彈性理論就有不合理性。所以將形成魚肉蛋白質凝膠網狀結構的部分和其他的凝集部分分離開來是必須的。構成凝膠結構的蛋白質為鹽溶性蛋白質即為肌原纖維蛋白質，約占肌肉總蛋白質含量的40%～60%，為肌肉中含量最多也是最重要的蛋白質，其中肌球蛋白和肌動球蛋白是形成和改善魚肉蛋白質凝膠彈性力的基本成分，而一些凝集的蛋白質也可以防止肌球蛋白的變性來強化凝膠的質構特性[13-14]，所以將凝集的蛋白質部分進行分離，關注肌球蛋白和肌動球蛋白凝膠的構造更為科學，而且對于魚肉蛋白質凝膠的保水機制以此為出發點的研究還比較鮮見。

1　材料與方法

1.1材料與設備

冷凍魚糜（SA級，Theragra chalcogramma）：阿拉斯加產；所有試劑均為分析純。

HAAKE RS-50動態流變儀：德國哈克公司；DLS-7000光散射光度計：日本大塚電子有限公司；Quanta250環境掃描電子顯微鏡：美國FEI公司。

1.2肌原纖維蛋白質的提取

根據Ojima[15]的方法從冷凍魚糜中提取肌原纖維蛋白質。

1.3肌原纖維蛋白質的確認

利用SDS-PAGE電泳法對是否為目的蛋白質進行確認。分別稱取0.4 g的肌動球蛋白和肌球蛋白，加入7.5 mL的8 mol/L尿素-2%SDS-2%2-mercaptoethanol-0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液煮沸，室溫下溶解24 h。之后進行離心分離（11 000 r/min，15 min）得到的上清液在0.1%SDS-0.01mol/L Tris-HCl（pH 6.8）溶液中透析24 h，然后根據Laemmli的方法進行電泳。電泳結束后，浸在0.05%CBB-10%醋酸-50%甲醇的染色液中室溫染色，之后加入10%醋酸-10%甲醇的脫色液進行脫色，直到看到清晰的顯色帶。

1.4動態黏彈性測定

在肌球蛋白及肌動球蛋白中添加冷卻的蒸餾水，使其水分含量達到目的含水率（89%～93%），同時添加NaCl使鹽濃度分別達到5%及10%，將得到的黏稠體進行充填，然后80℃加熱30 min后，放入冰水中冷卻10 min，最后置于5℃的冷藏室保存24 h，得到肌動球蛋白凝膠和肌球蛋白凝膠樣品。

利用動態流變儀（Rheostress RS-50 HAAKE）進行流變特性測定。將樣品凝膠制成厚度為1 mm的薄片，模具選用平板及PP35的探頭，頻率為1.00Hz，從20℃升溫至80℃，升溫速度為1.0℃/min，測定儲能模量G’。

1.5動態光散射測定

動態光散射是從粒子在溶液中并行運動，回轉運動，布朗運動使其位置發生變化的現象中測得的有關分子運動的情報中得到擴散系數，流體學半徑等要素的方法。為求得相關長（分子鏈與分子鏈之間相互作用的距離），利用光散射光度計DLS-7000（大塚電子有限公司）進行動態光散射測定，經測試可知肌動球蛋白凝膠與肌球蛋白凝膠的粒徑在5 μm以上的范圍，因而決定利用T.D.法（Time Domain）進行了測定。測定的光源設定為He-Ne激光（波長632.8 nm），測定溫度為（25±5）℃，測定角度為90°。

1.6肌原纖維蛋白質凝膠結構的觀察

與1.4相同的方法制備肌原纖維蛋白質凝膠，其最后的水分含量為91%～94%。制成圓柱形后保持在30℃的條件下浸置于丙酮和t-丁醇的混合液（體積比1∶1）中2 h，然后將浸置液替換為t-丁醇，由于t-丁醇的凝固點為25℃，所以取少量浸沒樣品后放置于冷藏室凍結。然后，置于凍結干燥裝置（JFD-310）的樣品室中，為了防止凍結的樣品融化，冷卻至-8℃后，樣品室進行排氣，干燥24 h。干燥后的凝膠用于環境掃描電子顯微鏡（FEI公司制、Quanta250）的樣品。樣品放置于溫度10℃，濕度100%，真空度1 200 Pa左右的樣品室內觀察，觀察時電壓設為20.0 kV，束斑為5.0。

1.7數據處理及分析

利用統計分析軟件（SAS Institute Inc.，Cary，NC）和origin 8進行數據處理和分析。

2　結果

2.1肌原纖維蛋白質的確認

肌原纖維蛋白質為肌球蛋白和肌動蛋白。肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成單位，由兩條分子量約為220 kDa的重鏈和分子量約為20 kDa的四條輕鏈組成。肌動蛋白是微絲的結構蛋白，分子量約為42 kDa的球狀蛋白質。因此利用SDS-PAGE實驗確認肌原纖維蛋白質，SDS-PAGE結果見圖1。

200 kDa的區域呈現出蛋白區帶，說明此為肌球蛋白重鏈，而在40 kDa的區域出現蛋白區帶可以確認其為肌動蛋白。

2.2肌原纖維蛋白質凝膠的架橋點間平均分子量

肌原纖維蛋白質凝膠彈性在此被看作為橡膠彈性[16]，所以保水性高，具有彈性的蛋白質凝膠的構造依存于架橋點密度，架橋點間平均分子量，架橋點間距離，架橋點間分子鏈的柔韌性等因素[17]。估算凝膠網孔大小的時候可以通過儲能模量來確定架橋點間平均分子量。儲能模量可以體現聚合物鏈的振動以及聚合體的結構，而本次研究中，將凝膠中相互纏繞的點假設為架橋點，而其彈性決定于儲能模量。因此，架橋點間平均分子量能在非晶態聚合物的橡膠彈性理論公式中測算出來，公式如下：

其中：ρ為密度，kg/m3；φ為聚合物的體積分數；R為氣體常數；T為絕對溫度，K；Me為分子量。

不同水分含量及鹽濃度對肌動球蛋白凝膠與肌球蛋白凝膠的架橋點間平均分子量的影響見圖2、圖3。

圖1　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1　SDS-PAGE

圖2　肌動球蛋白凝膠的架橋點間平均分子量與水分含量的關系Fig.2　Relationship between the water content and the molecular weight between the cross-linking points of actomyosin gels注：不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

從圖3可知，隨著水分含量的增加，肌球蛋白凝膠的架橋點間平均分子量也隨之增大。特別是鹽濃度為5%，水分含量超過91%的樣品中，架橋點間平均分子量顯著增大。這個結果表明，隨著水分含量的增加，凝膠結構中的網狀分子鏈的距離增大，另外，鹽濃度低會使肌原纖維膨脹，提高了表面積，暴露了更多的大分子蛋白來結合水分[18]，而高濃度會使肌原纖維中肌球蛋白尾部的α螺旋結構不穩定，螺旋結構折疊，空間結構變小[19]。同時鹽濃度增加，離子強度增大，離子鍵使網狀結構相對穩定，因而離子強度較低的鹽濃度為5%的凝膠在一定的水分含量處架橋點間平均分子量比鹽濃度為10%的大。肌動球蛋白凝膠也表現出類似的趨勢，但是當水分含量接近92%時，架橋點間平均分子量開始減小，這可能是在這個范圍已不能形成強固的凝膠。

圖3　肌球蛋白凝膠的架橋點間平均分子量與水分含量的關系Fig.3　Relationship between the water content and the molecular weight between the cross-linking points of myosin gels注：不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2.3肌原纖維蛋白質凝膠分子鏈間的相關長

動態光散射技術根據光子相關原理，檢測因布朗運動而產生的散射光強的漲落，從而得到散射質點動態行為的信息[20]。其中散射電場的一次相關系數由下式表示

這里g(1)（τ）為靜電場的相關系數；β為定數；D為擴散系數，cm2/s；τ為弛豫時間，μs；q為靜電場的強度。q可由下式表示

式中：n為溶劑的折射率；λ0為入射光的波長，nm。

在凝膠中網孔狀的分子鏈與分子鏈間能相互影響的距離為相關長。上述的D擴散系數適用于愛因斯坦·斯托克斯式表示如下

式中：T為絕對溫度，K；η為溶劑的黏度，Pa·s；ξ為相關長（架橋點間距離），nm；KB為波爾茲曼定數。

各水分含量及不同鹽濃度下肌動球蛋白凝膠分子鏈間相關長的變化見圖4。

鹽濃度為5%和10%的肌動球蛋白凝膠的相關長都隨著水分含量的增加而增加。另外，鹽濃度為5%的凝膠中，水分含量達到94%時，相關長減小。這預示著分子鏈開裂，從而顯現出的相關長減小。對于鹽濃度為10%的凝膠，水分含量即使不斷增加相關長仍舊沒有減小。這說明由于肌原纖維蛋白質的濃度高，蛋白質分子鏈密度大，使得相關長開始減小的現象延遲，隨著水分含量的繼續增加，可以預想相關長也會有減小的趨勢。

圖4　肌動球蛋白凝膠的相關長與水分含量的關系Fig.4　Relationship between the moisture and the correlation length of actomyosin gels注：不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

不同水分含量與鹽濃度的條件下，肌球蛋白凝膠分子鏈間相關長的變化見圖5。

圖5　肌球蛋白凝膠的相關長與水分含量的關系Fig.5　Relationship between the moisture and the correlation length of the myosin gels注：不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

從圖5看出水分含量增加到92%時，相關長也隨之增加，當水分含量超過92%，相關長開始減小。這有可能是形成網狀結構的分子鏈開裂達到均一的狀態所致。對相同水分含量條件下的凝膠進行比較，鹽濃度10%的肌球蛋白凝膠的相關長比鹽濃度為5%的小。這是由于鹽溶性的蛋白質濃度越高，使得形成凝膠結構的分子鏈的密度越大。這個變化趨勢和架橋點間平均分子量的變化一致。

2.4肌原纖維蛋白質凝膠的結構

利用環境掃描電子顯微鏡觀察所得的圖像見圖6、圖7。

圖6為各水分含量下鹽濃度為10%的肌動球蛋白凝膠的圖像。可以看到隨著水分含量的增加，其網孔有所增大，結構有顯現出均一化的趨勢。而從架橋點間平均分子量的結果推測水分含量接近92%時已不能形成強固的凝膠，故此時看到的結構中有部分分子鏈可能并沒有形成架橋。圖7為不同水分含量下鹽濃度為10%肌球蛋白凝膠的圖像。可以看到當水分含量增加到92%時，凝膠結構中的空間變大，當水分含量繼續增加時，網狀結構開始變密并漸漸不再清晰。

圖6　不同水分含量下肌動球蛋白凝膠的環境掃描電鏡圖（×1 000）（鹽濃度10%）Fig.6　The micrograph（ESEM×1 000）of actomyosin gels at different moisture（10%salted）

圖7　不同水分含量下肌球蛋白凝膠的環境掃描電鏡圖（×1 000）（鹽濃度10%）Fig.7　The micrograph（ESEM×1000）of myosin gels at different moisture（10%salted）

3　結論

通過對肌原纖維蛋白質凝膠保水機制的研究發現，隨著水分含量的增加，架橋點間平均分子量也表現出增大的傾向，同時，伴隨著水分含量的增加，相關長也隨之增加，達到一定的水分含量時，凝膠的相關長開始減小。這也預示著分子鏈的伸長以及在一定的水分含量領域中分子鏈開裂而變得均一化。另外從低真空掃描電子顯微鏡的圖像看來，在特定的水分含量處，凝膠的網狀結構中不僅僅是分子鏈的伸長，構成網狀結構的分子鏈也有所開裂，使得可見的纖維密度增加，導致結構產生變化。

綜上所述，凝膠的保水機制為在共價鍵沒有被破壞仍舊保持凝膠結構的前提下，隨著水分含量的增加，通過凝膠網孔的增大以及分子鏈的開裂而得以鎖住水分。如果能夠把握使構造發生變化的水分含量，通過上述的結果，便有可能計算出構成網狀結構的分子鏈開裂的條數，繼而構建出蛋白質凝膠結構的模型。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.009

收稿日期：2015-11-03

作者簡介：駱盧佳（1984—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品物性學。

Research on the Water Retention Mechanism of Fish-meat Gel

LUO Lu-Jia1，CHEN Ling1，Ogawa Hiroo2
（1.College of Agriculture and Environment，Jiaxing Vocational Technical College，Jiaxing 314036，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Technology，Tokyo University of Marine Science and Technology，Minatoku 108-8477，Tokyo，Japan）

Abstract：To elucidate the structure of the network from the water retention mechanism of fish-meat gel，the gel structures of actomyosin（AM）and myosin（M）were investigated.In the AM and M gels，when the moisture content increased，the molecular weight between the cross-linking points（Me）and the correlation length also increased，regardless of the salt concentration.When the moisture content continued to increase，the correlation length of gels began to decrease.From the micrographs of gels could be seen the similar phenomenon.This result suggested that in a certain moisture content，the size of the network was enlarged and the network chains were also cleaved.

Key words：myofibrillar protein；cross-linking；molecular weight；correlation length