大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的研究

畢元才（吉林農業工程職業技術學院，吉林四平136001）

大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的研究

畢元才
（吉林農業工程職業技術學院，吉林四平136001）

摘要：進行AB-8和D-280大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的研究，確定AB-8大孔吸附樹脂處理冬蟲夏草浸出液時的吸附特性，洗脫液用D-280大孔吸附樹脂進行脫色處理。研究結果表明：當用AB-8大孔吸附樹脂處理濃度為2.0 mg/mL的冬蟲夏草原液200 mL，上樣液的pH為6，多糖滲濾液的流速為0.8 mL/min，得多糖246.4 mg，再經D-280大孔吸附樹脂進行脫色處理，最后得到冬蟲夏草多糖207.1 mg。

關鍵詞：大孔吸附樹脂；冬蟲夏草；多糖；分離提純

冬蟲夏草，又稱冬蟲草、蟲草，它是麥角菌科真菌冬蟲夏草，寄生在幼蟲蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，其主要的藥用機理為調節機體免疫功能，在保護胃臟功能等方面有著重要的作用[1]。大孔吸附樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機溶劑的有機高分子聚合物，大孔吸附樹脂的孔徑與比表面積都比較大，AB-8樹脂是一種球形的弱極性聚合物吸附劑，該樹脂對多糖有特殊的選擇性，適合從水溶液中提取多糖物質。吸附樹脂粒可通過再生反復使用。D-280樹脂是一種大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂。該樹脂不僅具有適宜的孔徑和比表面而且在其交聯聚苯乙烯骨架中含有獨特的季氨基，利用具有此種結構和功能基的樹脂相以及乙醇介質對多糖和色素分子作用力的不同，使樹脂對色素分子有較大的選擇性和脫色溶量，從而達到樹脂對色素和多糖的分離[2]。本試驗主要研究了AB-8型大孔吸附樹脂對冬蟲夏草多糖的吸附特性中的原液濃度、上樣液pH和多糖液流速對多糖提取量的影響，并用D-280型大孔吸附樹脂對樣品液進行脫色處理，制備出高純度的冬蟲夏草多糖。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要試劑

AB-8型大孔吸附樹脂、D-280型大孔吸附樹脂：購于安徽三星樹脂科技有限公司；乙醇、鹽酸、檸檬酸均為分析純；含氨質量分數為5 g/kg～15 g/kg的乙醇溶液。

1.1.2主要儀器

分721型光光度計：上海分析儀器廠；NFA-02型旋轉蒸發儀：上海玻璃儀器二廠；ZK-82B型真空干燥箱：上海實驗儀器總廠；玻璃層析柱（直徑2.0 cm，長度30 cm）：北京頗賽科技發展有限公司；THZ-82型恒溫箱：廣東宏展科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1樹脂預處理及裝柱

用蒸餾水充分淋洗大孔吸附樹脂，用含氨質量分數為5 g/kg～15 g/kg的乙醇溶液浸泡2 h～3 h，去掉樹脂表面和孔道內殘留的溶劑和活性樹脂，用去離子水洗至中性，無醇味，采用濕法裝柱，將樹脂慢慢裝入直徑2 cm的玻璃柱中，樹脂高約23 cm[3]。

1.2.2多糖的提取工藝

提取冬蟲夏草多糖的工藝流程[4]：冬蟲夏草→粉碎→80%乙醇，45℃水浴回流脫脂2次→殘渣→晾干→加水溶解、浸提→過濾→合并濾液→濃縮→調節酒精度80%→沉淀多糖→無水乙醇洗滌→丙酮洗滌→乙醚洗滌→加水溶解→粗糖液→上AB-8樹脂柱→反復洗脫→收集洗脫液→D-280大孔樹脂脫色→45℃真空濃縮→冬蟲夏草多糖。

1.2.3多糖含量的測定及標準曲線的制作

采用苯酚-硫酸法[5]測定多糖含量。

標準曲線的制作：準確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖15 mg于50 mL容量瓶中，制備濃度為0.3 mg/mL葡萄糖溶液。準確量取葡萄糖溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別置于 10 mL容量瓶中，用去離子水定容。再各取1 mL上述試液于10 mL試管中，分別加入5%苯酚1 mL，混勻后，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻。沸水浴中反應15 min，取出后冷卻，用空白管調至0，在490 nm處進行吸光度測定，然后進行標準曲線的制作。

1.2.4AB-8樹脂靜態吸附容量的確定

將100 mL處理好的AB-8樹脂濕法裝柱，稱取5 g的冬蟲夏草多糖，蒸餾水溶解，過濾，將濾液通過樹脂柱，流出液反復上柱4次～5次，直至樣品被充分吸附為止，收集流出液。測定流出液多糖含量，按下式計算吸附率[6]

式中：C1為吸附前的多糖濃度，mg/mL；C2為吸附后的多糖濃度，mg/mL；E為吸附率，%。

1.2.5冬蟲夏草多糖液濃度對吸附的影響

按1.2.2方法，配置成1、1.5、2、2.5、3 mg/mL的多糖溶液，進行吸附試驗，考察不同糖液濃度對AB-8大孔吸附樹脂效果的影響。

1.2.6冬蟲夏草多糖液流速對吸附的影響

為了比較冬蟲夏草多糖液不同流速對吸附的影響，量取一定濃度滲濾液200 mL，以不同流速通過裝有100 mL的AB-8樹脂層析柱中。

1.2.7冬蟲夏草多糖液上樣液pH的確定

將200 mL一定濃度的冬蟲夏草多糖滲濾液用HCl和NaCl調不同pH，以一定的流速通過裝有100mL AB-8樹脂層析柱中，考察AB-8大孔吸附樹脂對不同pH的多糖液的吸附量影響。

1.2.8D-280樹脂脫色處理

將AB-8大孔吸附樹脂處理后的多糖液通過D-280樹脂，進行脫色處理，得到高純度的冬蟲夏草多糖。

2　結果與討論

2.1標準曲線制作

由實驗方法1.2.3繪制標準曲線，見圖1。

圖1　冬蟲夏草多糖含量測定的標準曲線Fig.1　The standard curve line of Cordyceps sinensis polysaccharide content determination

如圖1可見，冬蟲夏草多糖濃度（C）與吸光度差值（ΔA）成線性關系，其線性回歸方程為：ΔA=6.261 5 C-0.005 1，相關系數R2=0.999 4，說明冬蟲夏草多糖濃度與吸光度差值線性顯著相關，以標準曲線計算多糖含量。

2.2AB-8樹脂靜態吸附容量的確定

根據試驗方法1.2.4，將制得冬蟲夏草多糖滲濾液以1.0 mL/min的流速進入樹脂柱中，將樹脂柱用95%乙醇加入1%鹽酸溶液洗至無色，將洗脫液減壓蒸餾至粘稠狀，再置真空干燥箱內30℃以下干燥得1 mL AB-8型大孔吸附樹脂中約2.52 mg的多糖固體。

2.3冬蟲夏草多糖液濃度對吸附的影響

按1.2.5方法，考察不同糖液濃度對AB-8大孔吸附樹脂效果的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，原液濃度是影響樹脂吸附性能的重要因素之一，濾液的初試濃度在1.8 mg/mL～2 mg/mL較為合適。原液濃度偏低，耗時增加，影響工作效率。原液濃度偏高，則處理量小，泄露早，試驗周期短，會造成樹脂的再生次數增多。

2.4冬蟲夏草多糖液流速對吸附的影響

按照1.2.6方法，分別選擇流速為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min進行考察。結果見圖3。

圖2　原液濃度對冬蟲夏草多糖液吸附的影響Fig.2　The effect of dope concentration on the adsorption of Cordyceps sinensis polysaccharide solution

圖3　冬蟲夏草多糖液流速對吸附率的影響Fig.3　The effects of flow velocity of Cordyceps sinensis polysaccharide solution on the absorption rate

圖3表明，假如吸附操作到達穿透點后（流出液的目的產物的質量濃度達到進液質量濃度的5%時，即為吸附終點，達到吸附終點時流出液體體積定義為穿透點），繼續進料時，由于出口溶質濃度急劇增大，造成目標產物的損失，因此在實際操作中，需要在穿透點處停止操作，習慣上將出口濃度達到入口濃度的5%～10%時定為穿透點，本試驗采用5%時為穿透點。由圖3可見，隨著流速的降低，樹脂的吸附量增加，這是因為隨著流速的降低，固液接觸的時間增加，樹脂與料液接觸充分，所以隨著流速的降低樹脂的吸附量增加。當流速為0.5、1.0 mL/min時，樹脂的吸附量相差不大，但流速過低，導致操作時間延長，生產周期短，降低樹脂的生產能力，因此可選用糖液流速為1.0 mL/min。

2.5冬蟲夏草多糖液上樣液pH的確定

按照1.2.7方法，冬蟲夏草多糖滲濾液調pH 3、4、5、6、7、8，考察不同pH對樹脂吸附量的影響，結果見圖4。

如圖4所示，上樣液的pH對化合物的吸附和分離有一定的影響。在吸附的過程中物質一般以分子狀態被吸附劑吸附。結果顯示，當上樣液為原液即弱酸性時，洗脫的多糖的純度和含量都最大，可能冬蟲夏草的多糖類物質大多呈弱酸性，在弱酸性狀態下呈分子狀態被吸附劑吸附，偏酸或偏堿會使物質呈游離狀態，不利于吸附，可能在上樣的時候泄露出來。從而我們可以定義為當吸附率達到60%以上時，可認為上樣液的pH為最佳適宜值，即上樣液的最佳pH的范圍為4～6。

圖4　樣品液pH對樹脂吸附率的影響Fig.4　The effects of sample solution pH on the absorption rate of resin

2.6正交試驗

2.6.1試驗設計

采用AB-8型大孔吸附樹脂對冬蟲夏草多糖的提取液進行分離純化，確定上柱樹脂體積100 mL，在溫度15℃對樹脂分離純化過程中的主要因素如滲濾液原液的濃度、上樣液pH、多糖滲濾液的流速等進行考察，選用L9（34）正交表，因素水平設計如表1。

表1　大孔吸附樹脂吸附影響因素正交設計Table 1　The orthogonal design of adsorption factors on macroporous adsorption resin

2.6.2試驗結果

以冬蟲夏草多糖達到穿透點時，樹脂柱對冬蟲夏草多糖的吸附總量作為測評指標，確定最佳的吸附條件。按照正交試驗表安排試驗，結果見表2。

以冬蟲夏草的多糖的吸附率為考察指標進行極差分析可見各因素影響吸附量程度大小為B>C>A，其中上樣液的pH對吸附量有顯著的影響，A3B3C2為各因素的最佳水平，即當滲濾原液的濃度為2.0 mg/mL，上樣液的pH為6，多糖滲濾液的流速為0.8 mL/min為最佳的上柱吸附條件。

2.7D-280吸附樹脂脫色處理

將濃度為2.0 mg/mL的冬蟲夏草原液200 mL經過AB-8大孔吸附樹脂處理后的多糖，溶于70%的乙醇溶液中，以0.8 mL/min流速通過D-280樹脂柱，收集流出液，減壓蒸餾濃縮，干燥至恒重，稱量最終所得冬蟲夏草多糖重量為207.1 mg。

表2　正交試驗及結果Table 2　The orthogonal test and results

3　結論

用大孔吸附樹脂分離提純冬蟲夏草多糖的最佳工藝條件為：當用AB-8大孔吸附樹脂處理200 mL濃度為2.0 mg/mL的冬蟲夏草原液，上樣液的pH為6，多糖滲濾液的流速為0.8 mL/min，得多糖246.4 mg，再經D-280大孔吸附樹脂進行脫色處理，最后得到冬蟲夏草多糖207.1 mg。

參考文獻：

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[3]沈南英,曾璐,張顯恥.冬蟲夏草菌的分離[J].食用菌,1983(5):9-10 [4]劉杰麟,劉若英.戴氏蟲草胞外水溶性多糖在體外對細胞免疫及細胞因子的影響[J].中國藥學雜志,2001,36(11):738-741

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[6]Tian L L,White P J.Antipolymerization activity of oat extract in soybean and cottonseed oils under frying conditions[J].Journal of the American Oil Chemists’Society,1994,71(10):1087-1094

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.016

收稿日期：2014-07-09

作者簡介：畢元才（1963—），男（漢），副教授，碩士，主要從事食品加工方面的研究。

Research on the Separation and Purification of Cordyceps sinensis Polysaccharide by Macroporous Adsorption Resin

BI Yuan-cai
（Jilin Agriculture Engineering Polytechnic College，Siping 136001，Jilin，Chin）

Abstract：The separation and purification of Cordyceps sinensis polysaccharide by AB-8 and D-280 macroporous adsorption resin were researched，confirmed the adsorption characteristics when used AB-8 macroporous adsorption resin to deal with Cordyceps sinensis leachate，and the eluent was decolored and processed by D-280 macroporous adsorption resin.The results showed that when used AB-8 macroporous adsorption resin to deal with 200 mL concentration of 2.0 mg/mL of Cordyceps sinensis liquid，the pH of sample solution was 6，the flow velocity of polysaccharide leachate was 0.8mL/min，got 246.4 mg polysaccharide，which was decolored and processed by D-280 macroporous adsorption resin，finally got 207.1 mg Cordyceps sinensis polysaccharide.

Key words：macroporous adsorption resin；Cordyceps sinensis；polysaccharide；separation and purifaction