注射用復合維生素中草酸的HPLC法測定

李志偉，夏瑾，何慶國，趙麗榮，李瀟

（1.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北愛爾海泰制藥有限公司，河北 石家莊 051000；3.石家莊市食品藥品監督管理局，河北 石家莊 051000）

草酸，又名乙二酸，是人類代謝的終產物，不再分解.人體內的草酸主要有2個來源：1）腸道吸收食物中的草酸；2）體內代謝生成.尿草酸排泄量的60%以上為內生性草酸.草酸的體內生成主要基于2種形式：1）維生素C可不需酶的作用直接轉變成草酸，約占排出草酸的40%；2）由乙醛酸代謝產生，占40%～50%.由于維生素C可轉化為草酸，因此，認為維生素C是草酸鈣結石的可能危險因子.而高草酸血癥涉及骨、視網膜、動脈血管中層、周圍神經、皮膚和心臟.體內草酸過多會影響心肌或傳導系統，并能誘發心力衰竭和致命性心律失常［1－2］.因此在注射用復方維生素中控制草酸很有必要.中國藥典［3］中采用滴定的方法檢測維生素C中的草酸，文獻［4－6］報道的草酸測定方法大多采用反相高效液相色譜法，以C18柱進行分析，而注射用復合維生素中組分多，干擾對草酸的測定.本文建立了一種新的高效液相色譜法，用于注射用復合維生素中草酸殘留量的測定，該方法靈敏、準確.

1 儀器與試劑

儀器：Agilent LC1260型液相色譜，配有G1311C1260型泵，G1314B1260型檢測器，柱溫箱，G1329F1260型自動進樣器.色譜柱為Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7mm×150mm 的強陽離子交換柱（H＋型）.

樣品：自制批號：20101001，20101002，20101003；草酸對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號：101097－201101.

2 方法與結果

2.1 溶液配制

1）供試品試液的制備

取本品一瓶（約相當于維生素C 200mg），置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

2）對照品試液的制備

取草酸對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1mL中約含草酸10μg的溶液，作為對照品溶液.另分別取維生素C，維生素B1，維生素B2，甘氨酸，分別按照處方量配置各組分的溶液、空白溶劑.

2.2 色譜條件

色譜柱Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7 mm×150 mm 的強陽離子交換柱（H＋型）.柱溫60 ℃；檢測波長210nm，流速0.6mL／min；進樣量20μL.在此色譜條件下，各溶劑的保留時間見表1.各組分不干擾草酸的檢出，并且分離度均大于1.5，色譜圖見圖1.

圖1 各組分的液相色譜Fig.1 Chromatography of every compounds

表1 注射用復合維生素各組分出峰時間Tab.1 Retention time of Vitamin complex injection

2.3 線性實驗

取草酸對照品，用水稀釋配置1.0mg／mL的標準儲備液，逐步稀釋配置質量濃度為50，40，30，20，10，5，1μg／mL的溶液，進行分析，測定其線性關系，結果見表2，圖2.

表2 草酸的線性關系Tab.2 Liner relationship of oxalic acid

圖2 草酸的線性關系Fig.2 Linearity curve of oxalic acid

結果表明，草酸在1.0～50μg／mL的溶液中呈線性關系，線性相關系數為0.999 8.逐步稀釋草酸溶液，進樣量20μL，進行檢測限和定量限測定，結果顯示在S／N＝3時的草酸檢測限為0.015μg／mL，在S／N＝10時的草酸定量限為0.065μg／mL.

2.4 精密度實驗

配置6份10μg／mL的草酸溶液，分別進行液相色譜分析，結果見表3.由表3可見此法精密度良好.

表3 草酸的精密度結果Tab.3 Precision result of oxalic acid

2.5 回收率實驗

分別配制低（8.0μg／mL）、中10（μg／mL）、高（12μg／mL）3種不同質量濃度的對照品溶液，以“2.1”項下的對照品溶液作為對照.精密稱取供試品適量，分別加入上述不同濃度的對照溶液適量溶解，進行液相色譜分析，計算回收率.結果顯示，平均回收率為98.82%.

2.6 樣品測定

取長期留樣的樣品20101001，20101002，20101003按照上述方法進行了草酸的測定.

實驗結果表明，本品3 批樣品中草酸均低于定量限峰面積，小于積分值，因此認為是未檢出，均不過0.2%，符合規定.

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

由于草酸屬于離子型化合物，因此選擇離子交換型的色譜柱易于其保留并與其他組分分離，分別考察了Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7 mm×150 mm 的強陽離子交換柱（H＋型）、陰離子交換樹脂、SCX 等不同類型的色譜柱，結果表明，只有在Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7mm×150mm 的強陽離子交換柱（H＋型）色譜柱能夠實現各個組分的分離，并且分離度均大于1.5.

3.2 流動相的選擇

考察了不同濃度硫酸、磷酸等流動相對分離度的影響，結果表明，在0.01mol／L的硫酸溶液中分離效果最好，并且各個組分均不干擾草酸的測定.

3.3 檢測波長的選擇

以0.01mol／L的硫酸為對照溶液，配置20μg／mL的溶液，進行紫外分光光度計掃描結果見圖3.

圖3 草酸的吸收波長Fig.3 Absorption wavelength of oxalic acid

考慮到草酸為限度檢查，液相色譜檢測器的使用情況等，為了提高其檢測靈敏度，故選擇檢測波長為210nm.

3.4 柱溫的選擇

考慮到色譜柱ROA－Organic acid強陽離子交換柱（H＋型）的最佳使用溫度，選擇了45，50，55，60 ℃等溫度下的分離情況，結果表明溫度升高，加快組分的洗脫，在不影響分離檢測的情況下，選擇60 ℃作為分析條件.

因此，最終確定的色譜條件：Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7mm×150mm 的強陽離子交換柱（H＋型），0.01mol／L硫酸溶液為流動相，檢測波長為210nm，柱溫為60 ℃.

4 結論

建立了一種H＋陽離子交換的離子色譜分析方法，用于復合維生素中草酸的檢測，該方法有效地避免了維生素組分對草酸檢測的干擾，方法的專屬性好，靈敏度高，能有效地對實際樣品進行檢測，有望將該方法列入此類藥品中草酸檢測的標準方法.

致謝：感謝河北科技大學化學與制藥工程學院大學生自主實驗室對本課題的支持.

［1］ 盧鋒.內生性草酸代謝及影響因素研究進展［J］.醫學綜述，2012，18（1）：40－43.LU Feng.Research advances in endogenous oxalic acid metabolism and its influencing factors［J］.Medical Recapitulate.2012，8（1）：40－44.

［2］ 姚潯平，周江謹.離子排阻色譜法同時測定尿中草酸和檸檬酸研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2011，21（11）：2625－2626.YAO Xunping，ZHOU Jiangjin.Study on the determination of oxalic acid and citric acid in urine by ionic exclusion chromatography［J］.Chinese journal of health laboratory technology，2011，21（11）：2625－2626.

［3］ 國家藥典委員會，中國藥典［M］.2部.2010版.中國醫藥科技出版社，2010.

［4］ 劉樹彬，陸敏，張星辰，等.乙醛酸和草酸的高效液相色譜分析［J］.應用化工，2007，36（10）：1027－1029.LIU Shubing，LU Min，ZHANG Xingchen，et al.Determination of glyoxalic acid and oxalic acid by high performance liquid chromatography［J］.Applied Chemical Industry，2007，36（10）：1027－1029.

［5］ 彭婕，葛衛紅，談恒山，等.高效液相色譜法測定人尿液中草酸的含量［J］.中國醫院藥學雜志，2006，26（3）：299－301.PENG Jie，GE Weihong，TAN Hengshan，et al.HPLC determination of oxalate in human urine［J］.Chinese Hospital Pharmaceutical Journal.2006，26（3）：299－301.

［6］ 李永慶.食品中草酸的測定［J］.廣東化工，2007，34（10）：117－118.LI Yongqing.Detection of oxalic acid in foods［J］.Guangdong Chemical，2007，34（10）：117－119.