阿米卡星印跡微球的制備及其性能

田一方，郭利輝，梅曉蕓，張新愛，陳冠華

（江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

氨基糖苷類抗生素是一類高效廣譜抗菌藥物，在畜牧和水產業中主要運用于治療由革蘭氏陰性桿菌如大腸桿菌、產氣桿菌、痢疾桿菌、鼠疫桿菌、布魯氏菌等引起的病癥，且常被添加到飼料中，用于促進動物生長發育［1－2］.然而往往由于其不合理使用，導致在動物源性食品中過量殘留，長期食用會危害人體健康，引起各種不良反應［3－5］.因此，對食品中該類抗生素殘留的檢測勢在必行，很多國家和組織都規定了其最大殘留限量（MRL）［6－7］.針對動物性食品中氨基糖苷類抗生素的多殘留檢測，其方法可能受樣品基質的復雜性和檢測設備的影響，建立一種可快速、準確將其從樣品中分離凈化出來甚至達到富集效果的方法成為重中之重.固相萃取法是一種集提取凈化和富集作用于一體的前處理方法，已被運用于氨基糖苷類殘留檢測中［8］.然而目前市場上使用的大多數固相萃取柱都是非特異選擇性的萃取柱，其并不能對某類特定的目標分子進行高選擇性的凈化與富集.因此，尋找一種能簡便有效凈化和富集樣品中氨基糖苷類的方法是極需解決的問題.

分子印跡技術是一種分子識別技術，利用該技術合成的聚合物中具有與模板分子空間結構相匹配的空穴，并且空穴內還具有與其功能基團正好互補的作用位點，對特定類別的目標分子具有很高的選擇性吸附能力，可應用于結構類似化合物的分離、仿生傳感、催化等［9］.利用這種技術所制的聚合物被稱為分子印跡聚合物（MIP）.由于其高效的識別性能和獨特的理化特點，分子印跡技術依然成為一個受人關注的研究方向，在食品安全檢測中展現了十分廣泛的應用前景［10－12］.沉淀聚合是MIP制備方法中的一種，可制備出能直接用作固相萃取柱填料的微球形聚合物，避免了后期研磨粉碎對聚合物中某些結合位點的破壞.阿米卡星是氨基糖苷類抗生素中的一種，以該抗生素作為模板，可制備對氨基糖苷類抗生素具有特異選擇性的固相萃取填料，為高效凈化和富集氨基糖苷類殘留奠定物質基礎.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

B5500S－MT 超聲清洗機（上海必能信超聲有限公司）；BS 124S 電子分析天平（賽多利斯公司）；WW－1601 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；索式抽提器（鎮江華東器化玻有限公司）；HH－S8 數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）；SHA－B 水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）；H－180 超高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；真空干燥器（河南鄭州中天實驗儀器有限公司）；MultiMode8 原子力顯微鏡（美國布魯克公司）.

阿米卡星原藥（AMK，質量分數98%，西安博昌科技有限公司）；甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、偶氮二異丁腈（AIBN）、四氫呋喃（THF）、甲醇和冰乙酸均為分析純試劑.MAA 和EGDMA 使用前需經減壓蒸餾提純，MAA 的餾分溫度為60～63 ℃，EGDMA 餾分溫度為98～100 ℃，AIBN 用甲醇重結晶后使用.實驗用水為超純水.

1.2 AMK MIP微球的制備方法

分別稱取模板分子AMK 和功能單體MAA 0.05mmol和0.2mmol，溶于一定量的THF－水（體積比為7:1），置于室溫下過夜，使得模板分子和功能單體能夠充分結合.然后，依次加入交聯劑EDGMA 1mmol、引發劑AIBN 10mg.混合液超聲5min后，通氮氣5min，密封置于60 ℃的水浴恒溫振蕩器中持續反應24h.反應結束后，過濾聚合物，并依次用水、甲醇對其進行沖洗.用索氏提取器配以甲醇與乙酸體積比為9:1的溶液對處理過的聚合物進行洗脫，去除模板分子.通過調節水浴鍋的溫度，使洗脫溶劑45min循環1次，直到洗脫液無模板分子（紫外分光光度計測定洗脫液，未見紫外吸收）.用甲醇去除殘留的乙酸，洗至中性.最后，取出真空干燥并備用.非印跡聚合物（NIP）的制備過程，除不加模板分子外，其余步驟同MIP的制備.

1.3 標準曲線

配制濃度為0.3，0.5，1，2，3，4，5 mmol／L 的AMK THF－水（體積比7:1）溶液，在波長196nm 下，以溶劑為空白，用紫外分光光度計進行檢測，得到線性回歸方程.圖1為AMK 標準曲線，其方程為A＝0.427c－0.093，其中c為AMK 濃度.該標準曲線用于條件優化以及MIP性能研究.

1.4 MIP吸附性能測定方法

圖1 AMK 標準曲線Fig.1 Calibration curve of AMK

精確稱取MIP及NIP微球各50mg，置于10mL 比色管中，分別加入5mL AMK 的THF水溶液，在室溫下振蕩一定時間后以10 000r／min離心10min，取上層清液過0.45μm 濾膜，檢測吸附后AMK 的濃度.根據吸附前后溶液中AMK 濃度的變化，計算MIP 和NIP的吸附量Q（μmol／g）.

式中c0為AMK 的初始濃度（mmol／L）；cx為AMK 的平衡濃度（mmol／L），V 為溶液的體積（mL），m 為所用聚合物的質量（g）.

2 結果與討論

2.1 功能單體與模板分子比例的優化

在分子印跡過程中，功能單體的一端以氫鍵形式與模板分子結合，另一端則與交聯劑形成聚合物網絡，其間形成諸多空穴，并與模板分子相匹配.聚合物中形成的空穴數量對該聚合物的識別能力有著很大的影響，而這取決于功能單體和模板分子的比例.因此，首先要優化其比例.固定AMK 濃度為0.5mmol／L，逐漸增加MAA 的濃度.超聲10min后靜置過夜，以相對應濃度的MAA 作為參比溶液，分別測定其紫外吸收光譜，結果見表1.由于MAA 和AMK 形成了復合物致使其最大吸收波長由AMK 的196nm 發生顯著的紅移.隨著MAA的增加，形成的復合物的量逐漸變化，并且其吸光度在1:4時出現峰值.因此，可以初步確定AMK 和MAA 的最佳比例為1:4.

表1 AMK 和MAA比例對吸光度的影響Tab.1 Effect of ratios of amikacin and MAA on absorbance

在實際合成中分別使AMK 和MAA 物質的量以1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6的比例進行聚合，用合成的MIP分別對5mmol／L的AMK 吸附24h后進行吸附量（Q）測定，結果如圖2所示.最終，確定模板分子與功能單體的最優物質的量比為1:4.

2.2 溶劑的用量

在制備MIP過程中，溶劑的作用是使反應物能夠溶解于其中，便于其發生聚合反應，同時使形成的聚合物中產生多孔結構，有助于選擇性空穴的構成.因此，溶劑應能對功能單體和模板都具有較好的溶解性，同時還不會對兩者間的氫鍵相互作用產生顯著影響.包括AMK 在內的氨基糖苷類物質在分子印跡中常用的溶劑如乙腈、二氯甲烷、氯仿等中的溶解度很小，而在THF 中有較好的溶解度，同時THF 對MAA 也有較好的溶解度，故THF 被用作溶劑之一.由于氨基糖苷類在水中有極好的溶解度，為充分發揮溶劑在反應中的作用，水也被用作溶劑.但是，水可對功能單體和模板間的氫鍵相互作用產生破壞，影響選擇性空穴的形成，故其用量應進行優化.此外，溶劑功能單體或模板分子的配比決定了它們在溶劑中的濃度，當溶劑用量太小時，反應會趨向于本體聚合，反應物黏度增大，使得溶劑無法充分進入聚合網絡中從而形成塊狀物；而當溶劑用量太大時，會使MIP強度降低，其孔狀空穴結構不穩定，無法形成微球沉淀.因此，溶劑的配比和用量也至關重要，需對其進行優化.固定水的體積為1mL，使得水與THF 的體積比分別為1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，向上述溶液中分別加入等量的阿米卡星0.05mmol和MAA 0.2mmol靜置過夜，然后依次加入EGDMA 1mmol和AIBN 10 mg.按1.2 和1.4 的方法制備和測定，其中吸附實驗所用AMK 溶液濃度為5 mmol／L，結果如圖3所示.當溶劑用量為8mL（即水與THF的體積比1:7）時，聚合物微球吸附能力最好.

圖2 功能單體用量對MIP吸附性能的影響（n＝3）Fig.2 Effect of amount of the functional monomer on adsorption capacity of MIP（n＝3）

圖3 溶劑的用量對MIP吸附性能的影響（n＝3）Fig.3 Effect of solvent volume on adsorption capacity of MIP（n＝3）

2.3 交聯劑的用量

在制備MIP時，為了獲得較高的專一性，需要使功能單體彼此聚合后的聚合物鏈之間具有一定的交聯度，以形成聚合物網絡.當交聯劑用量太少時，形成的印跡空穴易變形，不能確保互補官能團的定位，使得其識別能力降低.而當交聯劑用量太大時，所形成的聚合物剛性變強，不易溶脹，使識別位點減少，并且高度交聯會阻礙分子傳遞，導致吸附量Q 降低.因此，需要對交聯劑的用量進行優化.EGDMA 在MIP的合成中經常被用作交聯劑，在AMK 用量為0.05mmol時，使其與EGDMA 物質的量比為1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，在60℃下聚合24h，測定各聚合物的吸附性能，其結果如圖4.當物質的量比為1:10時制得的MIP量較少，且吸附能力較弱，識別能力不強.隨著交聯劑用量增大，其MIP吸附量不斷變化，并在物質的量比為1:20時出現最高峰.因此，選取模板分子與交聯劑EGDMA的最佳物質的量比為1:20.

圖4 交聯劑用量對MIP吸附性能的影響（n＝3）Fig.4 Effect of amount of EGDMA on adsorption capacity of MIP（n＝3）

2.4 AMK 印跡微球的吸附等溫線

MIP的吸附等溫線可以反映模板分子平衡吸附量與溶液濃度變化的關系，為獲得MIP中結合位點的類型和數量等重要信息提供基礎數據.按照1.4所述方法測定常溫下MIP對不同濃度AMK 的吸附情況，吸附時間20h，得到吸附等溫線如圖5 所示.結果表明，隨著AMK 濃度的增大，MIP的吸附量逐漸增大.當AMK 濃度大于4.0mmol／L時，MIP曲線呈趨于平緩的狀態.而在同濃度范圍內，NIP 的吸附量隨著AMK 濃度的增加而呈非飽和趨勢增加.這表明MIP中確實形成了對AMK 具有特異選擇性的吸附作用位點，NIP中則無此類位點.

2.5 AMK 印跡微球的Scatchard分析

分子印跡中常用Scatchard［13］方程來評價MIP的結合特性，其方程式如下：

其中，Q（μmol／g）為吸附量，Qmax是最大表觀吸附量，c（mmol／L）為模板分子平衡濃度，Kd（mmol／L）為結合位點的平衡常數.在AMK 濃度范圍內，以Q／c對Q 作圖得圖6，其呈現分段線性關系.

圖5 MIP和NIP的吸附等溫線（n＝3）Fig.5 Adsorption isotherm of MIP and NIP（n＝3）

圖6 MIP吸附性能的Scatchard分析Fig.6 Scatchard anaiysis on adsorption capacity of MIP

分別對兩段線性部分進行線性回歸，可得方程

對照方程（2）可知，方程（3）和（4）的截距和斜率分別對應Qmax／Kd和－1／Kd，根據方程（3）可求得MIP對AMK 的高親和力結合位點的Kd為1.244mmol／L，Qmax為85.99μmol／g；根據方程（4）可求得MIP低親和力結合位點的Kd為15.385mmol／L，Qmax為596.48μmol／g.

2.6 AMK 印跡微球的吸附動力學曲線

吸附動力學曲線可以反映一定質量的MIP對固定濃度溶液中模板的吸附量隨時間變化的情況以及不同時刻對模板吸附速率的情況，可為實際樣品固相萃取方案的制定提供依據.參照1.4方法測定在不同時間后MIP對5mmol／L AMK 溶液的吸附量，結果如圖7所示.MIP的吸附量隨著時間的增加而逐漸增大，最終趨于平緩.隨著時間的推移，空穴逐漸被AMK 分子所占據，并且在360min后達到飽和吸附，而NIP達到平衡所需的時間更短，這是因為其無特異性結合位點.因此，MIP的飽和吸附量要遠遠大于NIP的飽和吸附量.

2.7 AMK 印跡微球的IPB值

在分子印跡中，印跡效果也可以用IPB（imprinting－induced promotion of binding）值［14］進行評價，其表達式為

其中，QMIP（μmol／g）為MIP對于模板分子的吸附量，QNIP（μmol／g）為NIP 對于模板分子的吸附量.QMIP和QNIP相差越大，即IPB值越大，表明相比于NIP，MIP的效果越好.AMK 溶液濃度為5mmol／L 時分別測定MIP和NIP的吸附量，得IPB值為122.18%，說明特異性選擇位點所產生的吸附量超過非選擇性位點的吸附量，表明印跡效果良好.

2.8 AMK 印跡微球對氨基糖苷類抗生素的吸附選擇性

MIP能否對同類抗生素產生選擇性將決定其能否在該類抗生素多殘留檢測中用于樣品的凈化與富集.按1.4方法分別測定了MIP和NIP對5mmol／L鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星以及妥布霉素溶液的吸附量，吸附20h，結果表明，MIP 和NIP吸附量（μmol／g）分別為61.5和28.3，55.6和26.9，89，2和33.8，82.0和31.3，72.1 和29.8.其中，MIP 對其吸附量分別為模板吸附量的53.9%，48.8%，78.2%，71.9%，63.2%，而NIP對測試的各氨基糖苷類的吸附量差別很小.說明NIP產生的吸附是非選擇性的，而MIP對測試的各氨基糖苷類的吸附量主要來源于其中選擇性吸附位點的作用，進而說明該MIP具有用于部分氨基糖苷類抗生素多殘留固相萃取凈化和富集的潛力.

2.9 AMK 印跡微球的重復使用性能

MIP的可重復使用性將決定其用于實際樣品測定中的成本.MIP按1.4方法反復操作，再生次數為橫坐標，吸附容量為縱坐標作圖，得圖8.圖中顯示，AMK 印跡微球經10次重復使用后，其吸附性能基本無下降，說明該MIP具備重復使用性能，可用作固相萃取柱填料.

圖7 MIP和NIP的動態吸附曲線（n＝3）Fig.7 Dynamic adsorption curve of NIP and MIP（n＝3）

圖8 使用次數對MIP吸附性能的影響（n＝3）Fig.8 Effect of reuse times on adsorption of MIP（n＝3）

2.10 AMK 印跡微球的形態

用原子力顯微鏡對AMK 印跡微球的形態進行觀察，見圖9.該圖的寬度等效于顯微鏡視野中5μm 長度，由此可見，合成的印跡微球基本呈球形，粒徑為0.3～0.5μm.

圖9 MIP微球的原子力顯微鏡圖像Fig.9 Image of MIP by atomic force microscope

3 結論

在優化條件下合成的微球形AMK MIP對模板分子展現了良好的特異吸附性能，對與AMK 結構類似的氨基糖苷類也表現出不同程度的特異吸附性能，具有用于氨基糖苷類抗生素多殘留檢測中樣品凈化和預富集前處理的潛力.

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