中華絨螯蟹蛻皮抑制激素多克隆抗體的制備及其表達(dá)分泌特征的組織學(xué)研究

張鳳娟，曹佳培，王鵬，穆淑梅，康現(xiàn)江

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省動物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）蛻皮抑制激素（molt－inhibiting－h(huán)ormone，MIH）屬于甲殼動物高血糖激素家族（crustacean hyperglycemic hormone family）神經(jīng)肽.該家族的激素包括：高血糖激素（crustacean hy－perglycemic hormone，CHH）、蛻皮抑制激素、性腺抑制激素（gonad－inhibiting hormone，GIH）、大顎器抑制激素（mandibular organ－inhibiting hormone，MOIH）.這些激素均包含6個半胱氨酸殘基，形成3個鏈內(nèi)二硫鍵.由于其結(jié)構(gòu)相似，它們也具有交叉的生物學(xué)功能［1－4］.這些激素產(chǎn)生于眼柄的端髓X 器（medulla terminalis X－organ，MT－XO）或無眼柄甲殼類前腦相應(yīng)的位置，釋放到竇腺，進(jìn)入血淋巴系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)甲殼類許多重要的生理過程［5－6］.

MIH 通過與蛻皮激素（ecdysone）相互作用調(diào)節(jié)甲殼動物蛻皮進(jìn)程［7］.以前的研究認(rèn)為MIH 只在甲殼動物的眼柄視上神經(jīng)節(jié)的X 器官中表達(dá)，但是具體在眼柄視上神經(jīng)節(jié)的哪幾種分泌細(xì)胞中表達(dá)尚且未知［8－9］.據(jù)報道，X 器官中，小神經(jīng)元細(xì)胞（直徑15～25μm）產(chǎn)生促色素細(xì)胞激素，而大神經(jīng)元細(xì)胞（直徑30～70μm）產(chǎn)生高血糖家族激素［3，10］.近年來研究發(fā)現(xiàn)，MIH 不僅在X 器官中有分布，而且在甲殼動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)和腦）中也存在，但與眼柄中的MIH 相比，可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的MIH 發(fā)揮不同的作用［3，11］.

本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)，對中華絨螯蟹MIH 進(jìn)行系統(tǒng)的研究，并對其在視上神經(jīng)節(jié)的分泌情況進(jìn)行了具體的研究，可以為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用中華絨螯蟹購自河北省白洋淀；新西蘭大白兔由河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；pET－30a載體（TaKa－Ra）、表達(dá)菌株大腸桿菌Rosseta（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 方法

1.2.1 中華絨螯蟹MIH 蛋白的表達(dá)與純化

按照姚燕等［12］的研究方法獲得中華絨螯蟹的MIH 基因，并構(gòu)建表達(dá)載體，構(gòu)建好的表達(dá)載體命名為pET－30a－MIH.

將pET－30a－MIH 質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosseta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃，200r／min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右時，用0.5mmol／L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4h，超聲破碎后，離心收集沉淀，用8mol／L 的尿素溶解2h，12 000r／min 4 ℃離心20 min，取其上清液用鎳柱進(jìn)行純化，純化后的蛋白用體積分?jǐn)?shù)為12%的SDSPAGE檢測.

1.2.2 多克隆抗體的制備及特異性檢測

按照常規(guī)方法制備兔抗多克隆抗體，在注射蛋白時，每次注射抗原2.0mg，間隔7～10d，注射4次；獲得免疫血清.利用雙向免疫擴(kuò)散法檢測抗體效價.用western blot法對血清的特異性進(jìn)行檢測，其中實(shí)驗(yàn)組以融合蛋白為抗原，以MIH 抗血清為一抗，而對照組以免疫前血清代替一抗，具體操作步驟按常規(guī)western blot法進(jìn)行.

1.2.3 MIH 在視上神經(jīng)節(jié)分布的免疫組織化學(xué)研究

解剖處于蛻皮間期的中華絨螯蟹眼柄置于布氏固定液（未加冰醋酸）中，4 ℃固定過夜，梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為6μm，50 ℃烤片；常規(guī)脫蠟至水，用體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2處理7～10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶.蒸餾水浸泡沖洗.用檸檬酸緩沖液（pH 6.0），采用微波修復(fù)法修復(fù)抗原.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BSA 室溫孵育30min.一抗（MIH 抗血清）4 ℃過夜孵育，對照組用PBS代替一抗進(jìn)行孵育.PBS浸洗3次，每次5min，在樣品上滴加抗兔生物素化二抗，37 ℃孵育20min，PBS洗掉二抗.加上SABC 37 ℃孵育20min，PBS沖洗SABC.滴加DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度脫水至二甲苯，中性樹膠封片.顯微觀察拍照.

2 結(jié)果

2.1 MIH 基因克隆結(jié)果

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果在250bp處有特異性條帶（圖1），與預(yù)期大?。?43bp）相符合.測序發(fā)現(xiàn)該片段與中華絨螯蟹蛻皮抑制激素成熟肽序列一致.

2.2 pET－30a－MIH 質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

構(gòu)建好的PET－30a－MIH 經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測在250bp處有目的條帶（圖2），表明表達(dá)載體構(gòu)建成功且讀碼框正確.

圖1 MIH 基因克隆結(jié)果Fig.1 Result of MIH cloning

圖2 重組質(zhì)粒PET－30a－MIH 雙酶切電泳結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion result of PET－30a－MIH recombinant plasmid

2.3 融合蛋白的表達(dá)與純化

將帶有pET－30a－MIH 質(zhì)粒的表達(dá)菌株Rosseta（DE3）經(jīng)誘導(dǎo)后用體積分?jǐn)?shù)為12%的SDS－PAGE 電泳檢測，在14.3ku與20.1ku之間有一特異條帶（圖3）.SDS－PAGE檢測融合蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，溶解后的包涵體蛋白用鎳柱進(jìn)行純化，得到較高純度的目的蛋白（圖4）.

圖3 融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.3 Expression of fusion protein in E.coli

圖4 融合蛋白鎳柱純化結(jié)果Fig.4 Purification of fusion protein using Ni－Resin

2.4 多克隆抗體效價及特異性的檢測

多克隆抗體經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散測定其效價為1:32（圖5）.用MIH 抗血清對融合蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，在14.3～20.1ku內(nèi)有1特異條帶，而對照組沒有，表明其特異性較高（圖6）.

圖6 融合蛋白western blot結(jié)果Fig.6 Western blot result of the fusion protein

2.5 MIH 在視上神經(jīng)節(jié)的免疫組織化學(xué)定位

康現(xiàn)江等［13］將中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)分泌細(xì)胞分為5種類型，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)端髓中的細(xì)胞類型1（ct）、細(xì)胞類型3（ct3）和細(xì)胞類型4（ct4）的核周圍呈陽性反應(yīng)，這表明ct1，ct3，ct4參與了MIH 的分泌（圖7）.而陰性對照中均無陽性反應(yīng).

端髓中的ct1細(xì)胞核周圍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，由于MIH 在視上神經(jīng)節(jié)中的合成和儲存量很低，所以并不是所有的ct1細(xì)胞核周圍均呈陽性反應(yīng)（圖7a）.ct3細(xì)胞核周圍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，由于切片方向不同，所以細(xì)胞核沒有完全呈現(xiàn)，但是依據(jù)其位置和核大小確定其為ct3（圖7a）.ct4周圍呈陽性反應(yīng)，故其也參與了MIH的分泌（圖7c）.

圖7 端髓中分泌MIH 的細(xì)胞免疫陽性反應(yīng)（bar＝50μm）Fig.7 Immune positive reaction of cells in medulla terminalia

在中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)的端髓與內(nèi)髓交界處發(fā)現(xiàn)ct2細(xì)胞核周圍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)（圖8a），同時在竇腺（SG）處也呈現(xiàn)免疫陽性反應(yīng)（圖8c）.

圖8 端髓與內(nèi)髓交界及竇腺免疫陽性反應(yīng)Fig.8 Immune positive reaction in SG and the edge of medulla terminalia

3 討論

中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)由外髓、內(nèi)髓和端髓組成，神經(jīng)分泌細(xì)胞主要集中分布在端髓，端髓在視神經(jīng)節(jié)中體積最大，有大量神經(jīng)分泌細(xì)胞分布.竇腺位于端髓與內(nèi)髓交界偏端髓處，由神經(jīng)分泌細(xì)胞軸突末端聚集而成，神經(jīng)分泌細(xì)胞分泌的激素可暫時儲存于此，之后排出運(yùn)輸至血液.中華絨螯蟹MIH 由眼柄視上神經(jīng)節(jié)中的X－器官分泌，與蛻皮激素共同調(diào)節(jié)著中華絨螯蟹的蛻皮周期［14－18］.中華絨螯蟹MIH 基因成熟肽編碼區(qū)含有228bp，編碼75個氨基酸殘基［19］，姚燕等［12］制備了中華絨螯蟹MIH 鼠抗抗體，并對抗體進(jìn)行了效價的檢測，但并未進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究.

康現(xiàn)江等［13］將中華絨螯蟹視上神經(jīng)節(jié)分泌細(xì)胞分為5種類型，在本實(shí)驗(yàn)中，除細(xì)胞類型5之外，其他類型的細(xì)胞均具有陽性反應(yīng)，證明細(xì)胞類型1、細(xì)胞類型2、細(xì)胞類型3和細(xì)胞類型4均參與了MIH 的分泌.MIH 在端髓細(xì)胞中分布，此結(jié)果與不同物種中MIH 的分泌位置的研究一致［20－21］.Gu等［22］研究發(fā)現(xiàn)，刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）中，MIH 在眼柄的分泌位置是端髓X－器官，但是，在其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，例如胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)中均無MIH 分泌.然而，在遠(yuǎn)海梭子蟹（Portunus pelagicus）中，MIH 不僅分布于眼柄中，在胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有分布［3］.而在中華絨螯蟹中，除了眼柄以外的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否分泌MIH 還不得而知，這也是今后的研究目標(biāo).在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在沒有細(xì)胞核分布的區(qū)域也有呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的，有可能是MIH 經(jīng)這些分泌細(xì)胞的軸突或結(jié)締組織被運(yùn)往竇腺暫時儲存或釋放.此結(jié)果與Stewart等的研究結(jié)果相符［3］.

本實(shí)驗(yàn)研究了MIH 在眼柄中的分泌位置，為甲殼動物內(nèi)分泌的研究提供新的資料，同時為解決蝦蟹類的早熟問題提供參考.

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