臭氧自體血治療痛風緩解疼痛的細胞機制研究

曹國慶，李秀華，武百山，倪家驤

臭氧可改善氧氣供應，增強免疫，釋放血紅素氧合酶1(HO-1)、熱休克蛋白70(HSP-70)，產生超級紅細胞，釋放干細胞，上調抗氧化酶［1-2］。臭氧自體血治療是補充性的臨床治療方法，已應用于乙型肝炎、糖尿病、退行性眼病、不同疼痛綜合征和缺血性外周血管病的治療［3］。前期的臨床研究顯示，臭氧自體血治療可以有效緩解痛風患者的疼痛，具有鎮痛作用，且患者耐受性良好、安全、沒有嚴重不良反應［4］。本研究旨在觀察痛風患者經臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白水平及炎性細胞因子水平的改變，在細胞水平上研究探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 病例入選與排除標準 入選標準:符合2006年歐洲抗風濕病聯盟 (EULAR)診斷痛風標準［4］，尿酸＞420 μmol/L;急性或慢性痛風男性患者，年齡20～60歲;痛風藥物治療效果不佳或產生嚴重不良反應;藥物治療有禁忌證。排除標準:不同意臭氧自體血治療;患心理精神疾病;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G-6PD)明顯缺陷;嚴重的過敏體質;應用血管緊張素轉化酶抑制劑治療;患甲狀腺功能亢進癥、血小板減少癥和嚴重心血管疾病;嚴重腎功能損害 (血漿肌酐清除率＜30 ml/min)。

1.2 一般資料 選擇2012年6月—2013年9月首都醫科大學宣武醫院疼痛門診符合入選與排除標準的痛風患者10例，均為男性，年齡 24～59歲，平均 (41.3±9.9)歲;疼痛性質為觸痛、酸痛或脹痛。患者均進行非隨機、非盲開放研究，簽署書面知情同意書。患者治療前的一般資料見表1。

1.3 方法 入室后靜脈穿刺，連接輸血抗氧化管路，監護儀監測臭氧自體血治療流程:273 nm分光光度計準確測量臭氧濃度1～100 mg/L，相當于氧氣濃度0.1% ～5.0%;抗臭氧的負壓瓶內含有3.8%枸櫞酸鈉20 ml，吸入200 ml靜脈血，將所設定濃度的臭氧注入負壓瓶與靜脈血充分混合后，再回輸體內;3次/周，共10次。其中臭氧由醫用氧氣 (100%)通過德國赫爾曼公司生產的臭氧發生器產生;混合氣體中臭氧的濃度為20 mg/L。

分別采集患者治療前、第5次治療后和第10次治療后的靜脈血5 ml。血液靜止2 h后以3 000 r/min離心10 min(離心半徑為3 cm)，取血清備用，樣品在-80℃條件下儲存。采用免疫比濁法檢測血清IgA、IgM、IgG和補體C3、C4水平;采用流式細胞微球陣列分析方法 (CBA)檢測患者IL-8、IL-12和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以 (±s)表示，采用單因素重復測量方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 10例患者有9例完成全部治療，1例由于交通原因完成7次治療。在臭氧自體血治療后，1例患者的 HBeAb和 HBsAb、1例患者的類風濕因子(RF)、1例患者的抗胰島素抗體 (ISN-Ab)均由陽性變為陰性。

2.2 患者臭氧自體血治療前后免疫球蛋白及補體水平的變化 患者治療前、第5次治療后和第10次治療后IgA、IgM、IgG和補體C3、C4水平比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 患者臭氧自體血治療前后炎性細胞因子水平的變化 患者治療前后IL-12、MCP-1水平比較，差異無統計學意義 (P＞0.05);患者治療前后IL-8水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.05)。患者第5次治療后和第10次治療后IL-8水平均低于治療前，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。

3 討論

痛風是因嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄障礙致血尿酸水平升高的一組異質性疾病，高尿酸血癥是痛風的危險因素［5-7］。目前，主要治療策略仍為控制急性發作、控制高尿酸血癥形成晶體，因此痛風治療非常有限［8-11］。本研究結果發現，臭氧自體血治療后炎性細胞因子IL-8水平下降，提示IL-8可能在痛風的發生發展中起重要作用。

表1 痛風患者治療前的一般資料Table 1 General information of gouty patients before treatment

表2 痛風患者臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白及補體水平比較 (±s，g/L)Table 2 Comparison of serum immunoglobulin cytokines and complement before and after ozonated autohemotherapy

表2 痛風患者臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白及補體水平比較 (±s，g/L)Table 2 Comparison of serum immunoglobulin cytokines and complement before and after ozonated autohemotherapy

時間 例數 IgA IgM IgG C3 C 4.37 ±0.29第 5 次治療后 9 2.87 ±1.34 1.19 ±0.20 10.94 ±3.29 1.65 ±0.33 0.34 ±0.10第10 次治療后 9 2.76 ±1.27 1.21 ±0.11 10.87 ±3.06 1.51 ±0.18 0.32 ±0.09 F治療前 9 2.96 ±1.31 1.00 ±0.15 10.80 ±2.65 1.68 ±0.44 0 0.39 0.22 3.25 0.86 0.15 P值值0.76 0.82 0.15 0.49 0.86

表3 痛風患者臭氧自體血治療前后IL-8、IL-12及MCP-1水平比較(±s，ng/L)Table 3 Comparison of IL-8，IL-12 and MCP-1 before and after ozonated autohemotherapy

表3 痛風患者臭氧自體血治療前后IL-8、IL-12及MCP-1水平比較(±s，ng/L)Table 3 Comparison of IL-8，IL-12 and MCP-1 before and after ozonated autohemotherapy

注:MCP-1=單核細胞趨化蛋白1;與治療前比較，*P＜0.05

時間 例數9 30.01 ±1.00 0.81 ±1.08 90.13 ±14.10第5 次治療后 9 15.36 ±0.62* 0.11 ±0.07 90.99 ±11.24第10 次治療后 9 10.36 ±0.61* 0.20 ±0.21 95.65 ±16.59 F IL-8 IL-12 MCP-1治療前14.73 1.40 1.22 P值值0.01 0.33 0.37

Kanevets等［12］發現，IgM抗體的F(ab')2片段與尿酸鈉 (MSU)晶體結合，IgM抗體在尿酸溶液中促進MSU晶體沉積，這種沉積作用依賴于IgM的完整結構。本研究結果顯示，治療前后IgM水平無差異，可能的機制是血清IgM抗體可以被特異性識別，在晶體表面起到穩定初始晶體核的作用。臭氧自體血治療后，1例患者的HBeAb和 HBsAb、1例患者的 RF、1例患者的ISN-Ab均由陽性變為陰性。可能的機制為痛風患者自身免疫功能低下，臭氧激活免疫系統產生干擾素、IL、抗氧化酶，并可以誘導機體產生臍血細胞 (CTL)和自然殺傷細胞 (NK)，改善肝臟氧供，激活免疫系統的CD4+和CD8+細胞及自身免疫，從而抵御病毒，攻擊和殺死病毒。然而其確切機制還需進一步研究。

IL-8主要來源于單核細胞和吞噬細胞，主要的生物學活性是吸引和激活中性粒細胞，中性粒細胞與IL-8接觸后發生形態變化，定向游走到反應部位并釋放一系列活性產物;這些作用可導致機體局部的炎性反應，達到殺菌和細胞損傷的目的［13］。IL-8參與單核細胞黏附力的粥樣硬化早期階段。IL-8獨特的功能特點是在急性炎癥部位t1/2相對較長。在炎性反應早期產生，但是數天和數周甚至更長的時間仍有活性，這與其他許多炎性細胞因子在體內幾小時內產生和清除不同［14］。IL-8對氧化物高度敏感，抗氧化物明顯減少IL-8的表達［15］。IL-8和其他化學因子調節氧化應激的作用是臭氧自體血治療痛風的基礎，也成為未來潛在治療痛風的目標。

在家兔急性痛風實驗模型上MSU晶體誘導關節炎，注入MSU晶體到膝關節引起明顯腫脹，觀察滑膜和滑膜液中性粒細胞滲透情況，注射后12～24 h在滑膜襯里發現細胞免疫反應性的蛋白質［16］。Dje N'Guessan等［17］證實，用他汀類藥物治療后氧化修飾低密度脂蛋白 (oxLDL)誘發IL-8和MCP-1分泌減少。本研究結果顯示，痛風患者臭氧自體血治療后IL-8減少，有助于解釋該治療具有抗感染鎮痛的作用。

痛風患者的炎性因子紊亂在發病機制中起重要作用。臭氧自體血治療臭氧濃度為20～55 mg/L，通過活性氧物質 (ROS)和脂質過氧化物 (LOPs)激活免疫系統可能造成大量抗感染性因子〔IL-10、IL-12、IL-13、轉化生長因子 (TGF-β)〕釋放。Bocci等［18］和Sagai等［19］報道，體外實驗臭氧1 min內能短暫性釋放IL-8，通過H2O2短暫的上升從細胞外進入細胞液中，激活核因子 (NF)-κB抑制IL-8，清除ROS不能產生IL-8。本研究結果也支持臭氧促進血清IL-8水平降低，IL-8水平升高可能加重患者痛風疼痛的癥狀或者痛風發作。與此相反，臭氧自體血治療期間患者均沒有痛風急性發作，首先患者疼痛明顯減輕后IL-8水平下降。可能慢性痛風患者的急性發作或持續疼痛的炎癥機制與IL-8有關，IL-8是痛風的重要遞質，也可能是痛風患者急性痛風發作和轉歸的預測因素。

本研究從細胞水平探討了臭氧自體血治療痛風緩解疼痛的可能機制，具有一定的創新性。存在的不足是患者對于治療后抽血檢查的依從性較差，導致研究患者例數較少;且本研究對象是痛風患者，設立正常對照組不符合倫理要求。因此，本研究在獲得患者書面知情同意后，采用非隨機、非對照、非盲開放的試驗設計。

臭氧自體血治療痛風緩解疼痛的細胞機制可能與抑制IL-8的釋放或作用有關，目前尚沒有臨床試驗評估IL-8治療痛風的有效性;痛風患者的IgM與MSU結合是否促進MSU晶體沉積尚未得出結果。解決以上問題需進行長期、前瞻性和對照研究，且臭氧自體血治療痛風緩解疼痛的確切機制也有待進一步研究。

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