藏雪蓮水提取物對中波紅斑效應紫外線輻射人角質形成細胞抗氧化作用的研究

郭 硯，孫 娟，王麗雯

本研究創新點:

藏雪蓮是高原地區傳統的珍貴藏藥，被藏族人民視為“圣藥”。本研究依據青海省高海拔、強紫外線和缺氧的地理環境，且其居住人群長期暴露于強紫外線環境，易導致皮膚光老化，以人角質形成細胞 (HaCaT細胞)作為研究對象，采用臺盼藍染色觀察細胞形態及死亡情況，MTS比色法檢測細胞增殖情況，酶標法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽 (GSH)含量、丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶 (CAT)活力，探討藏雪蓮水提取物對中波紅斑效應紫外線 (UVB)所引起的HaCaT細胞光老化的保護作用，為青藏高原藥材的開發和實際應用提供理論依據，同時為藏雪蓮光保護作用機制提供理論基礎。

皮膚老化是人體衰老的一個重要表現，皮膚老化分為兩種:一種是固有性老化，一種是由環境因素，如紫外線、吸煙、風吹等引起的外源性老化。皮膚每天均接受來自日光中紫外線的輻射，長期的紫外線輻射導致皮膚發生形態學、組織學和生理學的改變，稱之為光老化。陽光中紫外線分為3種:長波黑斑效應紫外線(UVA)(320～400 nm)、中波紅斑效應紫外線 (UVB)(280～319 nm)、短波滅菌紫外線 (UVC)(100～279 nm)，UVB是引起輻射損傷的最重要因素，主要損傷皮膚角質形成細胞 (HaCaT細胞)，增加皮膚組織中活性氧 (ROS)的生成量，進而產生超氧陰離子，使細胞內的過氧化氫 (H2O2)大量增多，H2O2分解產生大量自由基，引起一系列的氧化損傷［1］，誘導皮膚光老化的發生。藏雪蓮屬菊科鳳毛菊屬雪蓮亞屬的草本植物，又名雪蓮花，是中國西部高山特有的多年生草本植物，具有除濕散寒、通筋活血、強筋助陽的功效，民間多用于治療風濕性關節炎、婦女小腹冷痛、胎衣不下、閉經、麻痹不透、肺寒咳嗽、高山不適應癥等治療［2］，且有研究證實，藏雪蓮水提取物能夠增加小白鼠組織內超氧化物歧化酶 (SOD)活力［3］、增加谷胱甘肽 (GSH)含量［4］、降低丙二醛 (MDA)含量［3，5］，從而發揮抗氧化作用。但藏雪蓮水提取物對UVB輻射HaCaT細胞抗氧化損傷作用尚未見報道。故本研究主要探討藏雪蓮水提取物對UVB誘導的HaCaT細胞抗氧化損傷作用，為藏雪蓮水提取物對UVB光保護作用研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 藏雪蓮購自青海眾康醫藥連鎖有限公司，HaCaT細胞購自南京凱基生物科技發展有限公司;10%胎牛血清 (FBS)購自Biological Industries，DMEM培養基購自賽默飛世爾生物化學制品 (北京)有限公司，胰酶購自Solarbio公司，臺盼藍染色液購自美國Sigma生物公司，MTS購自Promega公司，SOD測試盒、GSH測試盒、MDA測試盒、過氧化氫酶 (CAT)測試盒均購自南京建成生物工程研究所;二氧化碳(CO2)培養箱購自上海力申科學儀器有限公司，IX71型Olympus倒置顯微鏡購自Olympus公司，飛利浦TL20W/12紫外線UVB燈管購自上海杰圖商貿有限公司，UV-340A UVB輻照度監視器購自北京精密儀器科技有限公司，X-Mark型BIO-RAD酶標儀購自BIORAD公司。

1.2 藏雪蓮水提取物的制備 根據文獻 ［3］，準確稱取100 g藏雪蓮 (經青海大學醫學院藥學系陳湘宏副教授鑒定)，加入蒸餾水浸泡過夜 (料液比為1∶5)，加熱至100℃后，文火 (85℃)煎煮2 h，每隔15 min攪拌1次，過濾，濾渣加蒸餾水后繼續煎煮，重復3次，過濾，合并濾液，冷凍干燥得藏雪蓮水提取物。

1.3 HaCaT細胞的培養 根據文獻 ［6］，HaCaT細胞以含10%FBS的DMEM為培養基 (內含10 U/ml青霉素和10 U/ml鏈霉素)，接種于培養瓶后，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養箱，當細胞達90%融合時用以傳代，取3～5代對數生長期的細胞用于實驗。

1.4 實驗分組 當HaCaT細胞達到85% ～90%融合時，將培養瓶內的細胞按1×106ml細胞濃度轉到96孔板或6孔板中繼續培養。當細胞達80%～90%融合時，分為低劑量輻射組 (30 mJ/cm2，輻射1 h)、高劑量輻射組 (60 mJ/cm2，輻射1 h)，低劑量輻射組進一步分為對照組、L-UVB組、L-UVB+低劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮 1 g/L)、L-UVB+高劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮5 g/L)，高劑量輻射組進一步分為對照組、H-UVB組、H-UVB+低劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮1 g/L)、H-UVB+高劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮5 g/L)。UVB輻射前1 h將HaCaT細胞用無菌PBS洗滌3遍，并加入不同濃度藏雪蓮水提取物于細胞培養基中，對照組用錫紙包住置暗處，其他組細胞打開培養皿蓋在預設好的UVB輻射儀中照射1 h后，立即用無菌PBS洗滌3遍，并加含10%FBS的DMEM培養基繼續培養18 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 臺盼藍染色 將經含10%FBS的DMEM培養基培養18 h后的96孔板，用無菌PBS洗滌3遍，各組細胞中每孔加入 0.4% 臺盼藍 50 μl，3 min，IX71 型Olympus倒置顯微照相系統觀察并攝片。

1.5.2 MTS比色法檢測細胞增殖 將經含10%FBS的DMEM培養基培養18 h后的96孔板各孔加入MTS溶液20 μl，37℃，5%CO2培養箱繼續孵育3 h。終止培養后，酶標儀上選擇490 nm波長測定各孔吸光度(A)值。

1.5.3 SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力檢測 選UVB輻射后損傷較輕組，按照南京建成生物工程研究所生產的測試盒說明書檢測SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力。

1.6 統計學方法 采用Sigma Plot 10.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臺盼藍染色結果 倒置顯微鏡顯示，UVB照射1 h后，L-UVB組與對照組比較，HaCaT細胞出現輕度腫脹、漂浮，但仍可看出細胞形態，且HaCaT細胞藍染數量增加;L-UVB+低劑量臧雪蓮組與L-UVB組比較，HaCaT細胞藍色數量未下降，細胞仍有水腫現象，脫片現象仍存在，但可見正常細胞形態;L-UVB+高劑量臧雪蓮組與L-UVB組比較，HaCaT細胞藍色數量下降，細胞水腫程度減輕，并且L-UVB+高劑量臧雪蓮組細胞形態接近對照組。H-UVB組與對照組比較，HaCaT細胞明顯腫脹，并出現細胞死亡成碎片及脫片現象，且細胞形態已模糊不清;H-UVB+低劑量臧雪蓮組和H-UVB+高劑量臧雪蓮組與H-UVB組比較，HaCaT細胞依然明顯腫脹，仍有細胞死亡成碎片及脫片現象，且細胞形態模糊不清 (見圖1)。

圖1 各組HaCaT細胞臺盼藍染色結果 (×10)Figure 1 Results of Trypan blue staining of HaCaT cells in each group

2.2 MTS比色法檢測細胞增殖 對照組、L-UVB組、L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組A值比較，差異有統計學意義 (P＜0.05);其中L-UVB組A值較對照組降低，差異有統計學意義 (P＜0.05);L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較L-UVB組升高，差異有統計學意義(P＜0.05，見表 1)。對照組、H-UVB組、H-UVB+低劑量臧雪蓮組、H-UVB+高劑量臧雪蓮組A值比較，差異有統計學意義 (P＜0.05);其中H-UVB組A值較對照組降低，差異有統計學意義 (P＜0.05);H-UVB+低劑量臧雪蓮組、H-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較H-UVB組升高，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表 2)。

表1 低劑量輻射組MTS比色法檢測A值比較 (±s)Table 1 Comparison of A value by MTS test among four subgroups ofL-UVB group

表1 低劑量輻射組MTS比色法檢測A值比較 (±s)Table 1 Comparison of A value by MTS test among four subgroups ofL-UVB group

注:L-UVB=低劑量中波紅斑效應紫外線，A值=吸光度;與對照組比較，*P ＜0.05;與L-UVB組比較，△P ＜0.05

組別 例數 A值對照組 5 2.15 ±0.14 L-UVB組 5 1.22 ±0.12*L-UVB+低劑量臧雪蓮組 5 1.69 ±0.08△L-UVB+高劑量臧雪蓮組 5 2.24 ±0.09△F 129.85 P值值＜0.001

表2 高劑量輻射組MTS比色法檢測A值比較 (±s)Table 2 Comparison of A value by MTS test among four subgroups of H-VUB group

表2 高劑量輻射組MTS比色法檢測A值比較 (±s)Table 2 Comparison of A value by MTS test among four subgroups of H-VUB group

注:H-UVB=高劑量中波紅斑效應紫外線;與對照組比較，*P＜0.05;與H-UVB組比較，△P ＜0.05

組別 例數 A值對照組 5 2.16 ±0.05 H-UVB組 5 0.55 ±0.01*H-UVB+低劑量臧雪蓮組 5 0.94 ±0.03△H-UVB+高劑量臧雪蓮組 5 1.99 ±0.09△F 值＜0.001 912.81 P值

2.3 SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力檢測結果 臺盼藍染色及MTS比色法結果顯示，藏雪蓮水提取物對H-UVB損傷的保護作用較弱，因此選用低劑量輻射組進行抗氧化損傷研究，對照組、L-UVB組、L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比較，差異有統計學意義 (P＜0.05);其中L-UVB組SOD活力、GSH含量、CAT活力較對照組降低，MDA含量較對照組升高，差異有統計學意義 (P＜0.05);L-UVB+低劑量臧雪蓮組GSH含量較L-UVB組降低、MDA含量較L-UVB組升高，差異有統計學意義 (P＜0.05);L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、CAT活力較L-UVB組和L-UVB+低劑量臧雪蓮組升高，MDA含量較L-UVB組和L-UVB+低劑量臧雪蓮組降低，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。

表3 低劑量輻射組SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比較(±s)Table 3 Comparison of SOD activity，GSH content，MDA content andCAT acivity among four subgroups of L-UVB group

表3 低劑量輻射組SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比較(±s)Table 3 Comparison of SOD activity，GSH content，MDA content andCAT acivity among four subgroups of L-UVB group

注:SOD=超氧化物歧化酶，GSH=谷胱甘肽，MDA=丙二醛，CAT=過氧化氫酶;與對照組比較，*P＜0.05;與L-UVB組比較，△P＜0.05;與L-UVB+低劑量臧雪蓮組比較，▲P ＜0.05

組別 例數 SOD活力 GSH含量 MDA含量 CAT 5 21.26 ±0.66 6.84 ±0.14 3.85 ±1.36 25.00 ±3.05 L-UVB組 5 17.36 ±1.48* 4.55 ±0.21* 8.25 ±1.02* 8.40 ±0.94*活力對照組L-UVB+低劑量臧雪蓮組 5 18.30±0.84 3.45±0.15△ 14.92 ±0.84△ 6.86±1.39 L-UVB+高劑量臧雪蓮組 5 29.65±1.78△▲ 8.01±0.27△▲ 6.94 ±0.24△▲ 34.21±4.33△▲F 241.00 895.88 218.43 135.25 P值值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

藏雪蓮產于青藏高原海拔3 000～6 000 m雪山雪線碎石間，在藏醫藏藥上藏雪蓮花作為藥物已有悠久的歷史，是藏族常用的一種民間藥物，在藏族古代藥物文獻《月王藥珍》《西部醫典》《西北域記》《蘭琉璃》《晶珠本草》及清代《本草綱目拾遺》中均有記載［7-8］。UVB可損傷HaCaT細胞，增加皮膚組織中ROS的生成量，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，進而產生超氧陰離子，使細胞內的H2O2大量增多，H2O2分解產生大量自由基，引起一系列的氧化損傷［1，9-10］，進而誘導皮膚光老化。目前，藏雪蓮水提取物在UVB誘導HaCaT細胞抗氧化損傷方面的作用未見報道。

本研究結果顯示，低劑量輻射組HaCaT細胞經臺盼藍染色后出現輕度腫脹、漂浮，藍染細胞數量增加，高劑量輻射組UVB對HaCaT細胞氧化損傷更嚴重，出現細胞死亡成碎片及脫片現象，細胞形態模糊不清，且無論是低劑量臧雪蓮還是高劑量臧雪蓮均不能減輕UVB對HaCaT細胞的氧化損傷，表現為給予藏雪蓮水提取物后HaCaT細胞形態仍模糊不清，細胞明顯腫脹，細胞死亡成碎片及脫片現象嚴重，而L-UVB+低劑量臧雪蓮組細胞形態明顯恢復，細胞藍染數量亦明顯下降，細胞死亡碎片及脫片現象明顯改善;MTS比色法檢測細胞增殖結果顯示，L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較L-UVB組升高，H-UVB+低劑量臧雪蓮組、H-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較H-UVB組升高，說明藏雪蓮水提取物能夠促進HaCaT細胞在UVB損傷后的增殖。

本研究結果顯示，L-UVB組SOD活力、GSH含量、CAT活力較對照組降低，MDA含量較對照組升高，與既往實驗結果相似［3-5］。L-UVB+低劑量臧雪蓮組GSH含量較L-UVB組降低、MDA含量較L-UVB組升高;L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、CAT活力較L-UVB組升高，MDA含量較L-UVB組降低;L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、CAT活力較L-UVB+低劑量臧雪蓮組升高，MDA含量較L-UVB+低劑量臧雪蓮組降低。說明L-UVB+低劑量臧雪蓮不能減輕UVB輻射對HaCaT細胞造成的輻射損傷，而L-UVB+高劑量臧雪蓮能夠減輕UVB輻射對HaCaT細胞造成的輻射損傷。但結合MTS比色法檢測結果可知L-UVB+低劑量臧雪蓮可以促進UVB輻射后HaCaT細胞的增生，但卻沒有抗氧化保護作用，可能由于低劑量輻射組與HaCaT細胞孵育時間太短，但其原因有待進一步研究。

本研究闡述藏雪蓮水提取物對UVB輻射后HaCaT細胞氧化損傷的保護作用，提出了低劑量藏雪蓮水提取物與HaCaT細胞提前孵育1 h不能減輕UVB輻射后HaCaT細胞氧化損傷，而高劑量藏雪蓮水提取物可以減輕氧化損傷，為進一步探討藏雪蓮水提取物在UVB的光保護作用的研究提供理論基礎。

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