利用有機溶劑提取微藻油脂的方法探究

殷海，許瑾，王忠銘，郝小紅，袁振宏，王亞兵

（1 上海理工大學能源與動力工程學院，上海 200093；2 中國科學院廣州能源研究所，廣東 廣州 510640 ）

能源是人類賴以生存的基礎，是促使經濟可持續發展的動力。目前為止，人類使用的能源絕大多數來自于傳統的化石燃料。然而隨著傳統化石能源的逐步耗盡、環境污染的日益嚴重，人們迫切要求可持續的發展，急需尋找新的清潔能源來替代傳統能源。生物質能源由于數量龐大、種類繁多的獨特優勢，已經被越來越多的決策者和科研人員所關注。

微藻作為一種用于生產生物柴油的極具潛力的生物質原料，逐漸成為人們關注的焦點[1-2]。微藻分布廣泛，種類繁多，并且適應能力極強，作為能源生物質，其還具有光合作用效率高、生產周期短、油脂產量高且品質優良、不與糧食競爭[3-4]，同時微藻還可以消耗環境中的CO2[5]等優點，使得微藻能源在新型可再生替代能源中顯得尤為突出。

微藻生物柴油的生產工藝包括微藻的規模化培養、微藻的采收、微藻油脂的提取和生物柴油的轉化等一系列環節[6]。其中，微藻油脂的提取是影響生物柴油推廣應用的一個關鍵環節。目前，微藻油脂的常用提取方法主要包括壓榨法和水酶解法，這些方法的油脂提取殘油率高[7]；其次有超臨界流體萃取、離子液體提取法[8-9]以及水熱液化技術[10]，這些方法對設備要求較高，成本較大[11]，并且超臨界流體萃取對于極性脂的提取率較低[12]；還有索氏提取法，該方法具有提取周期較長、能量消耗高、提取率低的特點；而最常見的是有機浸提法，該方法雖然對有機溶劑具有很強的選擇性，但其對設備要求低、操作簡單、提取率較高。

溶劑浸提法是利用能溶解油脂的有機溶劑，通過滲透、濕潤、對流擴散和分子擴散等作用，將微藻中的油脂溶解在溶劑中，再通過將浸提溶劑和油脂分離，進而得到粗脂[13]。極性溶劑能有效破壞膜蛋白間結合力，使得細胞膜疏松多孔，非極性溶劑可以很好的與細胞內油脂結合[14]，這使得雙溶劑體系在油脂提取中占有一定的優勢。本實驗利用有機溶劑提取微藻油脂，探究了不同的條件對微藻油脂提取率的影響，為微藻生物柴油的實際生產提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 微藻材料

小球藻藻粉，由中國科學院廣州能源研究所佛山三水能源微藻培養示范基地提供。

1.2 儀器設備

NewClassic 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋，河南鞏義予華儀器有限公司；TDL-5-A 型離心機，上海安亭科學儀器廠；HGC/HSC 系列氮吹儀，廣州易測儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微藻培養及藻粉制備

所用微藻為中國科學院廣州能源研究所三水區能源微藻培養示范基地戶外大型跑道池內養殖的小球藻，通過離心機收集微藻后，利用噴霧干燥設備制取得到干燥的藻粉，將干燥的藻粉密封放置在4℃的冰箱中待用。

1.3.2 提取劑的選擇

目前利用有機溶劑提取微藻油脂所用的提取劑主要包括氯仿-甲醇[15]、正己烷-異丙醇[16]、DMSO-甲醇混合液[17]、正己烷[18]、DUB、DUB-辛醇、二氯甲烷-甲醇[19-21]等，但是這些有機溶劑存在毒性強、成本高或沸點高難以分離等缺點。因此采用成本相對較低、沸點較低、毒性低的沸程為60～90℃的石油醚作為提取劑，同時使用甲醇和石油醚兩種有機溶劑作為提取劑進行了實驗探究。

1.3.3 微藻油脂提取

稱取200mg±10mg 的干燥藻粉于螺口的玻璃瓶中，按每次實驗所設計的液料比加入相應量的有機溶劑，放入所設計溫度下的恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋中，攪拌相應的時間后，取出玻璃瓶放入離心機中，在3500r/min 的轉速下離心5min，收集上清液，在氮氣保護下蒸發溶劑，轉移含有少量溶劑的總脂到預先稱重的EP 管中，在氮氣保護下蒸發溶劑至恒重，稱量得到總脂的質量，計算得出有油脂的提取率。

在使用甲醇-石油醚兩種有機溶劑提取微藻油脂時，按相應的液料比在玻璃管中第一次加入甲醇試劑，放置在所設定溫度的水浴鍋中加熱一定的時間，離心收集上清液后，再向玻璃管的剩余固體內加入等量的石油醚，恒溫加熱相同的時間，離心收集上清液，合并兩次所得的上清液，添加等量的去離子水使溶液分層，靜置10min，收集上層包含總脂成分的混合液后在氮氣作用下吹干至恒重，稱量得到總脂的質量，并計算得出油脂的提取率。

考察各種工藝參數對油脂提取率的影響以及實驗誤差的存在，每組實驗設置一個平行組，實驗重復兩次。

1.3.4 提取率的計算

微藻含油率的測定采用Bligh-Dyer 的快速油脂提取方法[22]，經測定本實驗所用微藻的含油率為11.07%。

2 結果與分析

2.1 提取時間對提取率的影響

在微藻油脂的提取中，提取時間對提取率有一定的影響。如果提取時間過短，有機溶劑不能充分穿透微藻的細胞膜進入細胞內，不能充分地與細胞內的油脂接觸；同時本實驗的單一有機溶劑采用的是石油醚（沸程60～90℃），低沸程的石油醚具有較強的揮發性，故提取時間過長會導致石油醚揮發造成有機溶劑的浪費，并且在工業應用時，提取時間過長必然導致生產周期變長，從而降低油脂提取效率同時增加生產成本。故實驗設計3h、4h、5h、6h 共4 個時間點，探究不同的時間對于該微藻的油脂提取率的影響，結果如圖1 所示。

圖1 提取時間對微藻油脂提取率的影響

由圖1 可以看出，在提取時間小于4h 時，油脂的提取率維持在一個較低的值；當提取時間超過4h時，油脂提取率上升；而提取時間超過5h 后，提取率上升速度變慢。這一實驗結果和實驗前的理論分析相吻合。但是從圖1 可以看出，時間的變化對油脂提取率的影響不明顯，故在本次實驗中提取時間不作為影響提取率的主要因素。綜合考慮，在本實驗中所設計實驗的提取時間為5h。

2.2 液料比對提取率的影響

利用有機溶劑提取微藻油脂主要是利用傳質推動力，同時利用固相主體和液相主體之間的濃度差[23]，從而使藻體內的油脂被攜帶出來，所以液料比就是影響這一進程的重要因素。液料比過小，會使得傳質推動力變小，不易將藻細胞內的油脂提取出來；而液料比過大會增加有機溶劑的使用量，從而使得成本大大升高，不利于大規模的推廣應用。因此，選擇一個合適的液料比十分必要。本次實驗按照有機溶劑的體積（mL）與微藻的質量（g）比分別為5mL/g、10mL/g、15mL/g、20mL/g 和30mL/g探究了在不同液料比時的提取率，所得實驗結果如圖2 所示。

圖2 液料比對微藻油脂提取率的影響

結果表明，在較低的液料比的情況下即所加入的有機溶劑較少時，提取率非常低；隨著所加入的有機溶劑的含量增多，提取率顯著升高；最后保持在某一個定值。為了獲取較高的微藻油脂提取率，選取液料比為15mL/g 作為最佳的工藝條件。

2.3 溫度對提取率的影響

溫度越高，分子運動速率越大，有機溶劑可以更快速地進入藻細胞內部，使得油脂提取所需的時間減少。但是，提取溫度有時會破壞微藻內的有效成分，而且需要考慮提取溶劑的沸點的限制因素[24]。同時較高的溫度必然會造成能量的浪費，這也是目前限制微藻能源推廣應用的主要制約因素。所以為了使生物柴油具有市場大規模應用所需的條件，同時最大限度地保持微藻內部的活性物質和油脂的品質。本實驗所探究的溫度條件都在接近常溫的條件下進行的，使得在消耗較少能量的同時可以獲得盡量高的提取率。實驗結果如圖3 所示。

實驗結果表明，在接近常溫時利用有機溶劑溶劑提取微藻油脂，油脂的提取率滿足先增后減的總體趨勢，在溫度為45℃時提取率達到最大值，隨后提取率下降。

圖3 溫度對微藻油脂提取率的影響

2.4 甲醇和石油醚分步提取對提取率的影響

通過上述單種溶劑的實驗可知，在選用石油醚作為提取劑，提取溫度為45℃，所加入的石油醚和微藻的比為15mL/g，并且加熱時間為5h 時，微藻油脂的提取率可以達到最大值為58.71%。但是該提取率仍然較低，在推廣應用的過程中就會造成微藻中殘余大量的油脂，從而造成能源浪費。為了進一步提高油脂的提取率，研究采用兩種溶劑分步作用來進行油脂的提取，本實驗采用極性較強的甲醇試劑和極性相對較弱的石油醚來提取微藻油脂。

按液料比為15mL/g 向微藻中加入極性較強的甲醇試劑，在45℃的條件下，加熱到指定的時間，充分破壞微藻的細胞膜，之后轉移溶劑后加入等量的石油醚溶劑在相同的溫度、加熱時間，利用油脂與石油醚相容的原理將油脂從細胞內部提取出來。結果得到，微藻油脂的提取率為77.16%，相比于之前的單一有機溶劑，油脂的提取率上升明顯。同時，在各個影響油脂提取率的因素中，考慮到溫度的來源需要消耗一定的能量，故在規模化的工業應用中應盡量使提取溫度接近常溫。為了滿足這一需求，實驗在雙溶劑提取時再次選用溫度作為單因素進行實驗，以尋找在可接受的提取率的范圍內的最佳溫度，結果如圖4 所示。

從圖4 可以看出，相比于單種溶劑，在提取劑上選用甲醇和石油醚兩種有機溶劑時，不僅僅在各個對應的溫度下油脂提取率有了較大幅度的提高，同時微藻在更低的溫度下，油脂提取率反而可以達到一個最大的值，即溫度為35℃時提取率就能達到87.90%，這不僅使得微藻油脂提取率有了較大的提高，同時使在微藻提取的過程中能量的消耗大幅降低。

圖4 改進后溫度對于油脂提取率的影響

3 結 論

（1）采用有機溶劑提取微藻油脂的過程中，有機溶劑的種類、溫度、液料比、時間對微藻油脂提取率都有著一定的影響，而影響本實驗所用微藻的主要因素是溫度和液料比，以石油醚作為提取劑，在溫度為45℃、液料比為15 mL/g、提取時間為5h 的條件下，微藻油脂的提取率達到最大值為58.71%。

（2）使用一種極性有機溶劑——甲醇、一種非極性溶劑——石油醚作為提取劑分兩步對微藻進行處理會使微藻油脂的提取率大大升高，同時所需要的提取溫度還可以相應地降低。實驗表明，在相同的液料比和提取時間的條件下，實驗溫度在35℃時微藻油脂的提取率會達到87.90%。

研究結果表明，在一定的溫度和料液比的條件下提取微藻油脂，使用甲醇和石油醚作為提取劑，可以得到較高的提取率，同時可以改善了目前微藻油脂提取中有機溶劑有毒、成本高、高耗能等缺點，為微藻油脂的工業化生產提供了一定的科學參考依據。

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