中華劍角蝗內生真菌Penicillium oxalicum次級代謝產物Secalonic acid A的分離及毒性實驗研究

楊小姣 鄒 坤 尉小琴 程 凡 覃慧林 賀海波 徐 幫 涂 璇

（1.三峽大學 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室 ＆ 湖北省土家族藥物研究所，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學 人民醫院 ＆宜昌市第一人民醫院，湖北 宜昌 443002）

昆蟲物種豐富，分布極為廣泛，在地球上處處可見其蹤跡.根據資料記載當前地球上生存的昆蟲物種大約有100多萬，是植物的3倍多［1－2］.昆蟲為了生存的需要，其體內存在著種類繁多的微生物（內生菌），它們與昆蟲一道長期共存.近年來，國內外的學者研究發現，昆蟲與其體內的微生物在共同生存過程中能夠產生許多具有鮮明結構特征、功能作用特色和良好生物活性的代謝及次生代謝產物，并由此開發出了大量的藥物中間體和新藥［3－5］.中華劍角蝗為直翅目蝗總科劍角蝗科劍角蝗屬的Acrida cinerea，又名中華蚱蜢、東亞蚱蜢等，廣泛分布于我國的南方、華北、東北、西北、青海、西藏等地區.營養學家研究發現，中華劍角蝗是一種優質的營養來源，其體內含有種類豐富的氨基酸、蛋白質、脂肪、多種礦物質及維生素［6－7］.

近年來，開展了中華劍角蝗的相關研究，先后從其腸道中分離28株內生真菌，并進行了逐一鑒定，其中一株經ITS rDNA分子生物學鑒定為Penicillium oxalicum［8］，通過進行Penicilliumoxalicum次級代謝產物的分離、純化，得到了Secalonic acid A.前期在細胞水平研究顯示，該化合物對多種腫瘤細胞如人肝癌細胞（HepG2）、人肺癌細胞（A549）、人宮頸癌細胞（Caski）、鼻咽癌細胞（CNE2）和人乳腺癌細胞（MDA－MB－231）均有顯著的生長抑制作用，IC50值分別為1.12、2.23、4.16、20.18和22.65μM，但對正常細胞如人永生化表皮細胞（HaCAT）和犬腎細胞（MDCK）的細胞毒性較小，IC50值大于100μM，同時還發現其對細胞具有一定的選擇性［9］.本研究擬在此基礎上在動物水平上開展其毒副作用實驗研究，為其臨床應用提供理論基礎和實驗依據.

1 材料

1.1 菌株

中華劍角蝗采自神農架林區大九湖公園，從其腸道中內生菌，經涂璇副教授鑒定為其中的一株為Penicilliumoxalicum（草酸青霉），實驗中采用此菌株進行實驗研究.

1.2 培養基

PDA培養基：去皮土豆200g，切成1×1×1cm3塊，煎煮1h后，過濾，取濾液，依次加入20g葡萄糖、20g瓊脂，然后加水至1 000mL；SDA培養基：取40g葡萄糖、10g蛋白胨、20g瓊脂，然后加水至1 000 mL.將上述兩種培養基經1.25×105Pa，滅菌20min后，備用.

1.3 動物

SPF級昆明小鼠，雄性，體重18～22g，由三峽大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2011－0012.動物受試環境，屏障系統；實驗動物使用許可證號，SYXK（鄂）2011－0061；實驗動物從業人員合格證號，Y20101234；飼料、飲水、墊料均符合《湖北省實驗動物質量控制標準》.

1.4 試劑

石油醚、乙酸乙酯，天津天力化學試劑公司；三氯甲烷、甲醇，天津恒興化學試劑公司；乙腈、甲醇，加拿大CALEDON LABORATORIES LTD公司；柱層析反相 硅 膠，YMC－GEL ODS－A，12nm，S－5μm，AA 12S50；Sephadex LH－20，美國Pharmacia公司，薄層色譜硅膠，青島海洋化工有限公司；柱色譜正相硅膠，煙臺化學工業研究所；其余試劑均為市售分析純.

1.5 儀器與設備

JA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠；Vortex－Genie 2型渦旋振蕩器，美國奧然科技有限公司；TP1020型脫水機，德國Leica公司；ULTRACUT R型超薄切片機，德國Leica公司；CS－V1型攤片烤片機，孝感市宏業醫用儀器有限公司；DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統，德國Leica公司；Olympus KX41型倒置顯微鏡，美國Thermo公司.

2 方法

2.1 中華劍角蝗腸道內生真菌的分離、純化及鑒定

取饑餓24h中華劍角蝗在無菌條件下解剖，取出的蝗蟲腸道在3%～10%的NaClO溶液中表面消毒5min，用75%EtOH消毒、超純水洗滌后，置于潔凈中研缽中加適量超純水研磨，取上清液稀釋成10－1，10－2，10－3，10－4濃度，然后取0.2mL 接種于PDA培養基上，放置在培養箱中培養.當菌絲長出后，取菌絲接種到新的PDA培養基上，如此重復3次后，再將其轉接到試管斜面上，提取基因組DNA，設計了通用引物對分離得到的菌株的總DNA進行擴增，然后進行DNA測序，將測序結果在NCBI的Blastn上進行序列相似性比對，最后鑒定3MZ－15為Penicilliumoxalicum（如圖1所示）.

圖1 中華劍角蝗腸道內生真菌分離、純化及鑒定

2.2 Penicillium oxalicum 次級代謝產物Secalonic acid A分離

Penicilliumoxalicum（3MZ－15）菌株用SDA培養基發酵40L，28℃培養20d，發酵液用8層紗布過濾后，分為上清液和菌絲體.上清液用乙酸乙酯萃取至無色，用旋轉蒸發儀50℃減壓濃縮至干，得乙酸乙酯部位（12.2g）.菌絲體在60℃條件下干燥，稱重（43 g），用甲醇：氯仿（1∶1）在60℃水浴鍋中浸泡提取，提取液用棉花紗布過濾，合并濾液，用旋轉蒸發儀50℃減壓濃縮至干，獲得菌絲體部位浸膏（10.6g）.取乙酸乙酯部位浸膏及菌絲體部位浸膏，用甲醇充分溶解，分別用石油醚：乙酸乙酯；乙酸乙酯：甲醇；氯仿：甲醇各梯度進行TLC分析，摸索最佳柱色譜分離條件，經綜合分析后選擇氯仿－甲醇體系進行梯度洗脫，且氯仿－甲醇為4∶1時使其所有的點展開兩部分浸膏，并分別對兩部分浸膏進行HPLC分析區別不大故將上述浸膏合并置于冰箱保存.總浸膏低溫條件下析出大量黃色針狀結晶，純化得Secalonic acid A（如圖2所示）.

2.3 Secalonic acid A急性毒性實驗劑量的確定

圖2 Secalonic acid A制備分離

根據國內外毒性試驗設計基本原則，采用序貫法來初步確定急性毒性實驗的劑量.在Secalonic acid A的急性毒性試驗中，初步擬定了175、550、1 750、5 000mg／kg 4個劑量.在配制溶液過程中，發現Secalonic acid A溶解性較差，無法將5 000mg的Secalonic acid A溶解在40mL的橄欖油中，故放棄該劑量.在實驗給藥中的劑量為175、550、1 750mg／kg.

2.4 Secalonic acid A的LD50測定

昆明小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g，清潔級，購自三峽大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2011－0012.動物受試環境：屏障系統，實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2011－0061，實驗動物從業人員合格證號：Y20101234.飼料、飲水、墊料均符合《湖北省實驗動物質量控制標準》.實驗小鼠禁食12h，不禁水，隨機分為4組：空白對照組和Secalonic acid A三個劑量給藥組，每組10只，分別按照175、550、1 750mg／kg藥物劑量（用橄欖油溶解），1次灌胃，灌胃體積為40mL／kg，空白對照組灌胃給予同體積的橄欖油.即刻及連續觀察7d，詳細記錄小鼠死亡數目、時間及主要毒性反應.利用概率單位法計算小鼠Secalonic acid A的LD50和95%的可信限.

2.5 實驗小鼠一般觀察

實驗期間逐日觀察小鼠外部體征、行為活動、尿、糞便性狀、口鼻眼分泌物及攝食量、飲水情況；實驗中，若出現動物死亡，即刻解剖，用肉眼觀察動物各器官外觀變化，然后進行組織形態學分析.

2.6 小鼠組織病理學研究

一般觀察結束后，取腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胃、十二指腸、大小腸等分別進行肉眼觀察和組織形態學分析.

2.7 數據統計分析

實驗數據用均數±標準差（x±s）表示，用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析進行多組間差異的比較分析；以Dunnett－t檢驗比較兩組間均數的差異；P＜0.05認為差異有顯著性.

3 結果

3.1 Secalonic acid A結構鑒定

Secalonic acid A為黃色針狀晶體，結合文獻報道［10－12］和實驗中波譜數據結果，確定該化合物為Secalonic acid A（如圖3所示）.

3.2 Secalonic acid A對實驗小鼠一般狀況影響

圖3 Secalonic acid A結構

研究發現，實驗小鼠灌胃給予Secalonic acid A后，靜臥少動，部分小鼠毛被松散，淚液增多和黑色稀便；死亡前出現呼吸急促、抽搐等狀況.觀察期間各組動物死亡時間及數目見表1.

表1 各組小鼠死亡只數及死亡時間表

3.3 Secalonic acid A對實驗小鼠系統尸解的影響

將頻臨死亡動物進行尸解，肉眼觀察機體各器官，可見肝臟表面呈紅褐色，有少量出血點，胃腸臌脹，小腸充血擴張余器官肉眼觀未見明顯異常（如圖4所示）.

圖4 實驗小鼠的肉眼觀察圖片

3.4 病理組織學檢查

光學顯微鏡下觀察，可見心肌內可見明顯的變性和壞死；心肌纖維變長呈波浪形，排列紊亂和斷裂；肌纖維間距增寬，肌節縮短，排列不規整；間質水腫、充血或出血，有炎癥細胞浸潤.在腎小管上皮細胞表現為嚴重變性，近、遠曲小管內膜脫落，腎小管內顆粒管型和蛋白管型，集合管間質大面積痕血，腎間質炎細胞浸潤.在小腸表現為粘膜表面淺表炎癥，表層柱狀上皮部分脫落，脾臟出現大面出血性壞死，其余臟器：如大腸、胃、肝主要表現為輕度淤血（如圖5所示）.

3.5 LD50的估算

由表2可初步估算出Secalonic acid A的LD50大約為100～200mg／kg，其準確的LD50劑量還需進一步實驗.

圖5 小鼠主要臟器HE染色照片

表2 小鼠給予各濃度Secalonic acid A灌胃試驗結果

4 討 論

本實驗首次從中華劍角蝗的腸道內生菌Penicilliumoxalicum的代謝產物中分離出Secalonic acid A，在前期研究證實具有良好的抗腫瘤活性的基礎上，進行了小鼠急毒性實驗研究.從當前Secalonic acid A的急性毒性實驗結果可以發現，該化合物的LD50大約為100～200mg／kg，具有較強的毒性，其毒性機制目前正在進一步研究之中.

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