中華鱉粉中氨基脲來源及相關性分析

曹愛玲，沈立，蔡路昀，張建人（.蕭山出入境檢驗檢疫局，浙江杭州208；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州20；.杭州蕭山天福生物科技有限公司，浙江杭州208）

中華鱉粉中氨基脲來源及相關性分析

曹愛玲1，沈立1，蔡路昀2，*，張建人3
（1.蕭山出入境檢驗檢疫局，浙江杭州311208；2.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；3.杭州蕭山天福生物科技有限公司，浙江杭州311208）

摘要：研究不同處理條件下中華鱉粉中氨基脲（SEM）殘留呈陽性的原因。研究從養殖環節、加工環節全鏈條分析氨基脲的可能來源。結果表明，養殖環節使用消毒劑與SEM呈陽性無關。高溫烘干會導致氨基脲呈陽性，且隨著烘干溫度的升高，氨基脲檢出值也隨之升高。中華鱉不同部位組織的氨基脲生成量存在著明顯差異，總體上鱉肉的SEM生成量高于鱉骨，但130℃高溫烘干時鱉骨的SEM含量要高于鱉肉；進一步的蛋白質分析表明，氨基脲的產生和樣品的蛋白質含量和組成密切相關。

關鍵詞：中華鱉；氨基脲；消毒劑；蛋白質

氨基脲（Semicarbazide，SEM）是呋喃西林的代謝產物，其與蛋白緊密結合，形成穩定的殘留物質。氨基脲結構簡單，來源廣泛，在食品生產加工過程中都可以產生[1-2]。目前已有文獻報道的食品中氨基脲的來源主要有獸藥呋喃西林的代謝物[3]、以偶氮二甲酰胺為發泡劑制作的食品接觸材料[4]、以及在食品車間和農業上使用次氯酸鹽進行衛生處理和消毒產生的氨基脲[5]等。我國是水產大國，每年有大量的水生動物源性產品出口，天然海捕水產品中曾檢出了氨基脲，如海捕蝦仁中檢出氨基脲，這顯然不能用呋喃西林的代謝物來解釋其來源。有研究認為，甲殼類水產品中含氨基脲極有可能就是動物自身產生的，并不是違規用藥的結果[2]。

中華鱉（Pelodiscus sinensis）屬龜鱉目（Testudinata）鱉科（Trionychidae）鱉屬（Trionyx），俗稱甲魚。我國是中華鱉的養殖和出口大國，由于活體中華鱉存在銷售周期短、產品風險高、附加值低等不利因素影響，國內企業正在向著中華鱉深加工產品-中華鱉粉方向發展，這既可出口創匯，又可減輕鮮活中華鱉面對市場的銷售壓力，促進中華鱉養殖業的可持續發展。然而在原料最終加工成中華鱉粉后卻出現了呋喃西林代謝物氨基脲殘留呈陽性現象，嚴重困擾和制約中華鱉粉產業發展。因此研究中華鱉粉加工過程中氨基脲生成量的差異及其相關性分析，對于有效控制氨基脲的產生，維護消費者健康以及保護我國出口貿易具有重要意義。本研究從中華鱉養殖環節、到加工環節，全程跟蹤分析，考查了不同養殖條件、不同加工條件下中華鱉組織樣品氨基脲生成量的差異，查找呋喃西林代謝物檢出陽性的原因，為中華鱉粉生產過程中氨基脲的控制提供理論參考。

1　材料和方法

1.1儀器與試劑

Alpha 1-4 LSC型冷凍干燥機：德國Christ公司；DGX-9143B-1型電熱循環烘箱：上海福瑪實驗設備公司；DJ-04BDJ-04型不銹鋼粉碎機：上海淀久中藥機械制造有限公司；Revco ULT-1786型超低溫冰箱：美國Thermo公司；Xevo TQ-S型液質聯用儀：美國Waters公司；Kjeltec 8400凱氏定氮儀：瑞典Foss公司；Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司；呋喃西林（純度≥99%）：Sigma公司；氨基脲鹽酸鹽和氨基脲同位素標準品（純度≥99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈等都為色譜純；其余化學試劑都為分析純。

1.2方法

本試驗從養殖和加工2個環節分析SEM陽性的可能來源。在養殖環節，用陽性藥物添加組作為對照，同時再另設2個試驗組，分別是消毒劑處理組和非消毒劑處理組，用于研究消毒劑是否對SEM產出造成影響。在加工環節，將中華鱉分成肉、骨2部分，并設定凍干、100、130℃3種條件下制成中華鱉粉。研究溫度及中華鱉自身不同成分對SEM生成的影響。

1.2.1前期準備

試驗飼料：本試驗期間所用飼料為出口中華鱉養殖場單獨加工配制，不添加任何藥物（陽性對照組飼料除外），飼料經實驗室檢測不含呋喃西林；試驗用水：本試驗期間所用養殖及加工用水均為自來水，經實驗室檢測不含呋喃西林，排除地下水等可能的環境污染；試驗中華鱉：本試驗中華鱉由溫室養殖至400 g左右，整個養殖過程避免接觸呋喃西林藥物，進入試驗池前，活體中華鱉經檢測不含SEM。以上試驗飼料、水和中華鱉呋喃西林原藥及SEM檢測結果見表1。

表1 本試驗各階段過程中呋喃西林原藥及SEM檢出量Table 1　Nitrofurazoneand SEM amountsin differentperiods μg/kg

1.2. 2試驗過程

將中華鱉放入準備好的甲、乙、丙3個暫養池中，甲為陽性對照組；乙為非消毒處理組；丙為消毒處理組。每個試驗組放40只400 g大小的中華鱉，做好日常水質管理，投喂無藥物殘留的試驗飼料，待馴化正常攝食一周后開始按試驗分組設計步驟進行研究試驗。

給甲組配制含有一定濃度的呋喃西林藥餌（2g/kg，10%有效含量），每天按中華鱉體重的1.5%～2.0%作為投喂量投喂藥餌，連續喂養3個月。乙組投喂不含藥物的試驗飼料，并且采取不施加任何消毒劑，連續喂養3個月，丙組投喂不含藥物的試驗飼料，并且采取正常消毒，連續喂養3個月。

1.3樣品檢測

3個月飼喂期結束后，將以上3組試驗中華鱉清洗-宰殺-分割成肉、骨頭，并分別凍干、100℃烘干和130℃烘干。將上述凍干、烘干的中華鱉肉、骨用粉碎機進行磨粉，按80目標準進行過篩，未過篩的重復再打磨一次。

1.3.1SEM的測定

樣品中SEM分析參考檢測方法[6-7]，具體如下，稱取2 g樣品，加入10mL甲醇溶液（1∶1，體積比），振蕩后4000 r/min離心5min，去上清。往殘留物中加入10mL，0.2mol/L鹽酸，10 000 r/min均質1min，依次加入內標工作液100μL，鄰硝基苯甲醛溶液100μL，混合30 s后振蕩30min，37℃恒溫箱衍生16 h。然后加入適量Na2HPO4溶液混勻后，調pH至7.4，加入10m L乙酸乙酯，振蕩10min后，10 000 r/min離心10min，收集上清液，重復提取一次，合并收集液，氮氣吹干后，殘渣用1mL 5%乙酸銨甲醇溶液溶解，再加入2mL正己烷，去除上層溶液后過0.22μm濾膜，取10μL供檢測。

色譜條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18，2.1 mm× 100mm，1.7μm，美國Waters公司；流動相A（乙腈），流動相B（0.1%甲酸溶液）；梯度洗脫0～7min，10%A-90%A；7min～10min，90%A；10min～10.01min，90% A～10%A；10.01min～20min，10%A；流速：200μL/min，柱溫：30℃。

質譜條件：離子源為ESI，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為MRM，定性離子對為209/192、209/ 166，定量離子對為209/166，駐留時間0.5 s，錐孔電壓25V，碰撞能量8 eV。

1.3.2蛋白質的測定

稱取2 g樣品與硫酸、催化劑等共同加熱消化，采用凱氏定氮法測定[8]。

1.3.3數據分析

采用SAS軟件進行分析，部分結果用平均值±標準方差表示。

2　結果與討論

2.1不同處理條件下的SEM生成量差異

采用內標法對不同處理條件下的樣品進行SEM定量檢測，結果如表2所示。

表2不同處理組的SEM殘留檢測Table 2　SEM amountof sam p lesunder differen t treatments μg/kg

呋喃西林代謝物SEM來源極為復雜，目前已經在不同的食品中發現了SEM，而且來源各異，除了使用呋喃西林藥物導致的代謝物殘留之外，食品包裝、面粉改良劑及食品加工程序都可成為食品中SEM污染的來源[9]。本研究在排除外界人為添加呋喃西林藥物的情況下，仍在中華鱉粉中檢出了SEM，且SEM在肉、骨中的分布與人為添加呋喃西林藥物的殘留分布不一致，表明自然狀態下，中華鱉粉中SEM的存在與外界呋喃西林藥物污染無關。

有研究表明，食品加工過程中，經次氯酸鹽處理后，會檢測到氨基脲SEM[5，10]。中華鱉粉在后續加工過程中均未接觸消毒劑，唯獨在養殖過程中會對水體定期使用消毒劑進行日常殺菌消毒。本試驗結果顯示，不使用消毒劑組的鱉粉中也檢出了SEM，說明養殖中使用消毒劑與SEM檢出無直接關系。

根據本試驗，中華鱉粉中呋喃西林代謝物的來源與干燥工藝有關，且與烘干溫度呈正相關。100℃烘干溫度下處理的中華鱉，其呋喃西林代謝物檢出為微量的1μg/kg～2μg/kg。據此推測，該溫度可能是中華鱉粉原料在高溫下發生化學變化產生呋喃西林代謝物的臨界溫度。而隨著溫度的升高，呋喃西林代謝物形成也逐漸增多。高溫處理下，骨粉中呋喃西林代謝物的形成明顯高于肉粉，這可能與骨、肉在蛋白質含量及氨基酸組成上的差異密切相關。

2.2蛋白質含量檢測及其與SEM生成量相關性分析氨基脲為聯氨類化合物，其來源與樣品中的含氮物質密切相關。為了進一步探究氨基脲的產生來源，用凱氏定氮法對中華鱉肉和鱉骨樣品中的蛋白質含量進行測定，重復3次取其平均值，結果如表3所示。

表3　不同處理條件下的中華鱉肉和鱉骨的蛋白含量（n=3）Table3　Protein content ofm eatand boneof turtleunder different treatments（n=3）%

從表3中得知，用不同的干燥條件處理樣品，氨基脲生成量在鱉肉中的含量要高于鱉骨（除130℃烘干條件外），而表3上鱉肉的蛋白質含量要顯著高于鱉骨，這表明一般情況下氨基脲生成量與樣品中的蛋白質含量存在著很高的關聯性，蛋白質含量高的鱉肉比其他蛋白含量低的鱉組織更容易產生氨基脲。但對于130℃烘干條件下，鱉骨中產生了比鱉肉中更高的氨基脲生成量，這也證明了氨基脲的生成不僅跟樣品中蛋白質含量有關，還可能與樣品中的其他組分，比如氨基酸組成有關聯，謝冬冬等[5]研究發現，被處理的動物組織中的氨基脲含量隨著不同部位中蛋白質及氨基酸含量的上升而隨之增加，蛋白質含量越多，氨基脲的含量越高，其中精氨酸含量的差異是導致氨基脲生成量差異的主要原因。

3　結論

外源添加呋喃西林藥物后，制成的中華鱉粉中SEM主要殘留在肉中，肉中殘留濃度是骨中的3倍，而非外源添加藥物造成的SEM殘留在肉、骨中含量基本均衡，差異不顯著。

中華鱉在整個養殖加工過程中僅養殖環節會使用消毒劑，而本試驗結果顯示養殖過程中使用消毒劑組與不使用消毒劑組均微量檢出SEM，由此推論中華

鱉養殖過程使用消毒劑，與中華鱉粉中SEM的檢出無直接關系。

凍干處理的中華鱉粉中呋喃西林代謝物檢測呈陰性，而烘干處理的呋喃西林代謝物檢測呈現陽性，且呋喃西林代謝物檢測濃度隨著烘干溫度的升高而升高。此外，在130℃高溫處理下，骨粉中呋喃西林代謝物的形成明顯高于肉粉，這可能與其氨基酸組成差異有關。

參考文獻：

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.001

收稿日期：2014-04-14

基金項目：浙江檢驗檢疫局科研項目（ZK201151）；國家自然科學基金（31401478）；“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD29B06）

作者簡介：曹愛玲（1981—），女（漢），獸醫師，碩士，主要研究動物獸藥殘留。

*通信作者

Correlative Analysis on the Occurrence of Sem icarbazide of Pelodiscus Sinensis

CAOAi-ling1，SHENLi1，CAILu-yun2，*，ZHANG Jian-ren3
（1.Xiaoshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 311208，Zhejiang，China；2.College of Food Scienceand Technology，BohaiUniversity；Food Safety Key Lab of Liaoning Province；National&Local JointEngineering Research Centerof Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；3.Hangzhou Xiaoshan Tianfu Bio-tech Co.，LTD，Hangzhou 311208，Zhejiang，China）

Abstract：This paper studied the reason of remains psitire in Pelodiscus Sinensis powder under different treatments.The possible source of SEM was investigated from breeding to processing throughout thewhole chain. The results indicated that the use of disinfectantswas irrelevantwith SEM positive，while high temperature of drying wowld cause SEM positive.The amount of SEM was higher as the drying temperature was higher.The amount of semicarbazide was distinctly different between different tissues，and meatwas higher than bone，except for 130℃drying treatment.Further analysis showed that semicarbazide generation was closely related with protein contentand their composition.

Key words：Pelodiscus sinensis；semicarbazide；disinfectant；protein