復合抑制劑對酪氨酸酶反應動力學的影響

王慶華，何云，王曉藝（.廣東藥學院基礎學院，廣東廣州50006；.廣東藥學院中藥學院，廣東廣州50006）

復合抑制劑對酪氨酸酶反應動力學的影響

王慶華1，何云2，王曉藝2
（1.廣東藥學院基礎學院，廣東廣州510006；2.廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006）

摘要：采用L-多巴氧化法分別研究了肉桂酸、壬二酸和4-己基間苯二酚兩兩復合對酪氨酸酶二酚酶的抑制作用。Lineweaver-Burk圖形分析表明，壬二酸和4-己基間苯二酚屬于競爭性抑制劑，肉桂酸屬于非競爭性抑制劑。兩種競爭性抑制劑復合（壬二酸和4-己基間苯二酚）的直線相交于縱軸上同一點，而一種競爭性和一種非競爭性抑制劑復合（肉桂酸和壬二酸、肉桂酸和4-己基間苯二酚）得到的直線相交于第二象限，但不交于同一點。用King-Altman方法推導復合抑制劑對酶作用的反應速率方程，從理論上分析了上述兩種類型的復合抑制劑Lineweaver-Burk直線的特點，得出的結果與試驗結果一致。

關鍵詞：酪氨酸酶；復合抑制劑；動力學；壬二酸；4-己基間苯二酚；肉桂酸

酪氨酸酶可逆性抑制劑廣泛應用于醫藥、臨床檢測、食品加工、環境監測等多個領域[1]，而且越來越多的研究人員從在植物提取物中尋找酪氨酸酶抑制劑[2-4]，在一些研究工作和生產實踐過程中，往往存在多個抑制劑同時作用于酪氨酸酶的情況，如植物提取物、復方藥物制劑或食品、化妝品的復合配方中，發揮功能作用的酶抑制成分常常不局限于一種，還可能涉及兩種甚至多種抑制劑復合作用[5-10]。若簡單地以粗提取物（混和物）對酶抑制作用的Lineweaver-Burk圖判定抑制劑的類型，并不能很好地反映多種抑制劑共同作用于同一酶靶點的情況，甚至可能會得到錯誤的結論。King-Altman方法運用圖形輔助來推導復雜酶反應動力學方程，可簡化推導過程[11]。本文以常見的酪氨酸酶可逆抑制劑肉桂酸、壬二酸、4-己基間苯二酚兩兩混合，從復合抑制劑對酶活性抑制試驗和酶作用速率方程推導分析兩個方面，探討兩種可逆抑制劑復合對酪氨酸酶二酚酶作用的動力學特點。

1　材料和方法

1.1材料

蘑菇酪氨酸酶（845U/mg）：Worthington公司；L-多巴：廣州菲博生物科技有限公司；壬二酸（99%）、肉桂酸（99%）、4-己基間苯二酚（99%）：上海阿拉丁公司；DMSO：sigma公司。

752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；HH-1型電子恒溫水浴鍋。

1.2方法

1.2.1酪氨酸酶二酚酶活性測定

在10m L試管中加入1m L L-多巴（1.0mmol/L），3.8mL pH6.8的PBS溶液，充分混勻，于30℃水浴中保溫10min后，加入酶液0.2mL（634U/mL），混勻，測定反應開始2min時在475 nm處的吸光度A，以吸光值A每分鐘增加0.001為1個酶活力單位。

1.2.2抑制劑對酪氨酸酶活性的影響

加入各種不同濃度的抑制劑，保持酶量和反應溶液總體積5.0mL不變，按1.2.1方法測定抑制劑存在下不同底物濃度對酪氨酸酶二酚酶活性的影響。各種抑制劑均以DMSO溶解后配制，兩種抑制劑復合的比例是根據試驗測得的每種抑制劑單獨作用時的半抑制率濃度IC50之比確定。

2　結果

2.1單一抑制劑對酪氨酸酶活性抑制作用

肉桂酸、壬二酸、4-己基間苯二酚對酪氨酸酶二酚酶的抑制作用Lineweaver-Burk圖，見圖1。

圖1　單一抑制劑對酪氨酸酶催化L-多巴活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.1　Lineweaver-Burk p lots for inhibition on theoxidation of LDOPA by tyrosinase

不同濃度的壬二酸、4-己基間苯二酚的Lineweaver-Burk直線交于縱軸同一點，最大反應速率Vmax不變，Km隨抑制劑濃度增大而增大，屬于競爭性抑制劑；而不同濃度肉桂酸的Lineweaver-Burk直線交于橫軸同一點，Km值不變，Vmax隨抑制劑濃度增大而減小，是酪氨酸酶二酚酶的非競爭性抑制劑，實驗結果與以往文獻報道[12-14]一致。

2.2復合抑制劑對酪氨酸酶活性抑制作用

復合抑制劑對酪氨酸酶二酚酶作用的Lineweaver-Burk圖，見圖2。

圖2　復合抑制劑對酪氨酸酶催化L-多巴活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.2　Lineweaver-Burk p lots for inhibition of com posite inhibitor on theoxidation of L-DOPA by tyrosinase

一定比例復合的壬二酸和4-己基間苯二酚復合抑制劑的Lineweaver-Burk圖的各直線交于縱軸上的同一點，與單一競爭性抑制劑的圖形類似，見圖2a′；而肉桂酸與壬二酸、肉桂酸與4-己基間苯二酚分別按一定比例復合，復合抑制劑濃度越大，直線斜率越大，不同濃度的復合抑制劑直線的交點都位于第二象限，不在同一點，見圖2 b′、c′。

3　討論

單一抑制劑的酶抑制動力學Lineweaver-Burk直線都交于同一點：競爭性抑制劑交于縱軸，非競爭性抑制劑的交于橫軸，混合型抑制劑的交于第二象限。與單一成分抑制劑的Lineweaver-Burk直線交于同一點的情形不同，肉桂酸（非競爭性）和壬二酸（競爭性）復合共同作用于酪氨酸酶的Lineweaver-Burk直線都不交于同一點，肉桂酸（非競爭性）和4-己基間苯二酚（競爭性）復合共同作用于酪氨酸酶的Lineweaver-Burk直線亦顯示同樣實驗結果。壬二酸和4-己基間苯二酚是兩種競爭性抑制劑復合，其Lineweaver-Burk圖形與單一競爭性抑制劑的類似，各直線都交于縱軸上同一點。在此可推導兩種競爭性抑制劑及一種競爭性抑制劑和一種非競爭性抑制劑復合作用于同一個酶的反應速度方程，并分別討論這兩種情況的復合抑制劑動力學特點。

3.1兩種競爭性抑制劑復合對酪氨酸酶活性的抑制作用

因為競爭性抑制劑結合在酶的活性中心，所以兩種競爭性抑制劑就不能同時與酶結合。圖3為兩種競爭性抑制劑共同作用的酶反應方程。

圖3　兩種競爭性抑制劑共同作用的酶反應機制Fig.3　M echanism of enzym ic catalytic reaction for two com petitive inhibitors

兩種不同的競爭性抑制劑I1、I2同時與酶作用。圖中[S]是底物濃度，[I1]、[I2]是抑制劑濃度，Km為米氏常數，Ki為抑制劑、或底物、或中間復合物反應平衡常數，ki為相應的反應速率常數。用King-Altman法推導酶反應速度方程，其King-Altman圖形見圖4。

圖4　兩種競爭性抑制劑復合作用酪氨酸酶的各種存在形式和k乘積Fig.4　Each enzyme form sand k productof two com petitive inhibitorson tyrosinase

以下是反應速率方程的推導過程，式中v代表酶催化反應的速率，Vmax是最大反應速率。

Lineweaver-Burk方程為：

Lineweaver-Burk圖的縱軸截距1/Vmax不變，表觀Km為

。設[I]為兩種抑制劑混合的總濃度，[I1]：[I2]=α，則[I]=[I1]+[I2]，[I1]=α[I2]。

表觀Km則等于可看作復合抑制劑表觀抑制常數。若KI≤K，可以證明KI≤K.I≤K，

1I21I2即K.I介于KI1和KI2之間。

3.2一種競爭性抑制劑I1和一種非競爭性抑制劑I2對酶的抑制作用

I1和I2結合在酶的不同位點，因此可以同時與酶結合，其反應式見圖5。

圖5　一種競爭性和和一種非競爭性抑制劑共同作用的酶反應機制Fig.5　M echan ism of enzym ic catalytic reaction for one competitive inhibitor and onenoncom petitive inhibitor

在用穩態處理時，推導酶作用速度方程的過程非常復雜，而用快速平衡態的處理方法相對簡單，ES分解為產物P屬慢反應，快速達到平衡時可忽略。King-Altman矢量圖參考文獻許根俊《酶的作用原理》[11]，略去推導酶促作用速度方程的詳細過程。

為求不同抑制劑濃度的Lineweaver-Burk圖各直線的交點坐標，可列方程組：

由上述推導的兩種抑制劑復合作用的酶反應速率方程分析可知，兩種競爭性抑制劑復合共同作用于酶，與單一競爭性抑制劑的圖形一樣，不同抑制劑濃度的酶動力學Lineweaver-Burk直線縱軸截距不變，橫軸截距小于0，交點位于縱軸上的同一點，說明兩種競爭性抑制劑復合作用，不改變酶促反應的最大反應速率Vmax，但表觀Km值增大，復合抑制劑表觀介于兩種抑制劑的抑制常數K.I之間。據此可以解釋實驗中壬二酸和4-己基間苯二酚復合對酪氨酸酶二酚酶作用，與單一競爭性抑制劑具有相似的Lineweaver-Burk圖形。一種競爭性和抑制非競爭性抑制劑復合，交點橫軸坐標1/[S]小于0，縱軸坐標1/v大于0，交點位于第二象限，且交點位置與[I1]、[I2]相關，表觀Km增大，Vmax減小。若I1、I2以一定比例混和，[I]越大，[I1]、[I2]越大，直線斜率越大，不同[I]濃度的一簇直線不交于一點，但各交點都位于第二象限，與單一抑制劑的圖形不一樣，見表1所示。據此則可解釋實驗中肉桂酸和壬二酸、肉桂酸和4-己基間苯二酚這類由一種非競爭和一種競爭性抑制劑復合對酪氨酸酶作用的Lineweaver-Burk圖形。由此可見，對于成分復雜的混合物，單從Lineweaver-Burk圖無法確定究竟是單一成分抑制劑的作用，還是兩種或兩種以上抑制劑的作用。

表1　各種類型抑制劑的Lineweaver-Burk作圖比較Table1　The com parison of Lineweaver-Burk plots for each inhibitor

4　結論

可逆抑制劑的酶反應速度方程推導是基于單一抑制劑成分的作用，所劃分的可逆抑制劑類型，如競爭性抑制劑、非競爭性抑制劑、反競爭性抑制劑和混合型抑制劑，只是對單一成分抑制劑而言。在研究動植物提取物、復方中藥等對酶活性抑制作用時，由于酶抑制成分未知或較為復雜，不同濃度抑制劑Lineweaver-Burk圖直線的交點有可能不共點。研究者容易忽視這一現象，往往簡單地根據酶抑制劑作用的Lineweaver-Burk圖直線的交點位置來判定抑制劑的作用類型，而實際可能是多種抑制成分共同作用的表觀結果，這個表觀結果與混合物中各抑制成分的濃度比例有關，尤其當提取物中含非競爭性抑制劑與競爭性抑制劑時，Lineweaver-Burk直線交點在第二象限，不在同一點，若試驗中存在測定誤差，則很容易被認為是單一混合型抑制劑類型，這也是在實際研究中，植物提取物較常被確定為酪氨酸酶混合型抑制劑的可能原因之一。多種抑制劑復合，具有不同于單一抑制劑的作用特點，抑制劑之間往往具有相互協同作用的效應[15]，其作用機制值得深入研究。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.010

收稿日期：2015-03-28

作者簡介：王慶華（1969—），男（瑤），教授，碩士，從事生物活性物質研究與開發。

Effects of Compound Inhibitorson Reaction Kinetics of Tyrosinase

WANGQing-hua1，HEYun2，WANGXiao-yi2
（1.SchoolofBasic Courses，Guangdong PharmaceuticalUniversity，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Schoolof TraditionalChinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，510006，Guangdong，China）

Abstract：The inhibitory effects of combinations of cinnamic acid，azelaic acid and 4-hexylresorcinol on the activity of tyrosinase diphenolaseactivitywere studied bymeasuring theoxidation rateof L-dopa.The inhibition kinetics analyzed with Lineweaver-Burk plots demonstrated that azelaic acid and 4-hexylresorcinol were competitive inhibitors，cinnamic acid wasnoncompetitive inhibitor.Lineweaver-Burk plotsof the combinations of two competitive inhibitors（cinnamic Acid and azelaic acid）showed a familyof lineswith a common intercept on the 1/v axis，but the straight lines of the combinations of one competitive inhiitor and one noncompetitive inhibitor（Cinnamic acid and azelaic Acid，Cinnamic acid and 4-hexylresorcinol）showed different intersection points in the second quadrant.The kinetic equation of composite inhibitorwas derived with the King-Altman plotand the characteristic of Lineweaver-Burk plotsof composite inhibitorwasalso analyzed，the experimental resultswere consistentwith theoreticalanalysis.

Keywords：tyrosinase；kinetics；composite inhibitor；azelaic acid；4-hexylresorcinol；cinnamic acid