柑橘皮中GSH的復合酶法提取及熒光檢測

蔣景龍（陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723001）

柑橘皮中GSH的復合酶法提取及熒光檢測

蔣景龍
（陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723001）

摘要：研究復合酶法提取柑橘皮中還原型谷胱甘肽（GSH）的工藝條件，以鄰苯二甲醛（OPA）與GSH反應形成熒光體系，熒光光度法測定GSH含量。結果表明：柑橘皮中GSH的最佳提取工藝為：料液比1∶40（g/mL）、溫度50℃，時間90min，pH 5.0，柑橘樣品GSH提取量為9.06mg/kg。在最佳提取條件下，分別提取了日南1號、興津、沙田柚、山下紅、金桔、朱紅橘、宮川、泛亞皇后、泛亞冰糖和城固冰糖中的GSH，熒光光度法測定GSH的提取量為7.81mg/kg～13.39mg/kg。熒光光度法的回收率達96.7%～99.3%，滿足測定準確度的要求。

關鍵詞：柑橘；還原型谷胱甘肽；鄰苯二甲醛；熒光分光光度法

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是體內重要的內源性抗氧化劑，對氧化應激和免疫功能具有重要的調節作用[1-2]。GSH具有抗腫瘤、抗氧化、保肝、抑制艾滋病病毒保護機體免受艾滋病病毒的侵害等多種生物功效[3-5]。GSH作為生物活性添加劑應用在保健食品中在強化食品風味的同時對人體有保健作用，它在食品加工業中的應用前景顯然要優于其它防腐劑或抗氧化劑。中國產業信息網發布的《2015-2020年中國注射用還原型谷胱甘肽行業運營態勢及未來前景預測報告》指出，截止2015年，中國GSH還不能完全滿足市場的需求，主要依靠進口，因此GSH的研究是人們關注的焦點。而且，植物對重金屬的解毒和忍耐能力大多與植物中的GSH等化合物有關[6-7]，許多研究者都利用柑橘皮作為原料制備吸附劑對重金屬污染的水體進行處理[8]，然而柑橘皮GSH含量檢測鮮見報道。本文采用復合酶法提取10種柑橘中的GSH，并用熒光法測定了其中GSH的含量，以期為柑橘中GSH的提取及檢測方法提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

本試驗用柑橘均由陜西省城固縣郭家山泛亞柑橘種植基地提供。GSH標準品：Sigma公司；以鄰苯二甲醛（OPA）：上海五聯化工廠；木瓜蛋白酶1.3× 10-5kat/mg、纖維素酶3×10-5kat/mg、果膠酶1.7× 10-5kat/mg：上海源葉生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制及其他試劑均為分析純；三次蒸餾水。

Hitach F-4500熒光分光光度儀：日本日立公司；Rotina 420R臺式離心機：德國Hettich科學儀器公司；DHG電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；FE20PH計：Mettler Toledo；CLF-06C新型密封式粉碎機：浙江溫嶺創力藥材器械廠；JXL-2S-6A數顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇金祥龍電子有限公司；超純水儀：四川優普超純科技有限公司。

1.2方法

1.2.1溶液的配制

1.2.1.1GSH標準系列溶液配制

準確稱取GSH標準樣品10mg，加水溶解后于100mL容量瓶中定容，即為100mg/L的儲備液；量取5mLGSH儲備液，加水定容到100mL，即得5mg/L的標準溶液。吸取該標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2m L，分別置于10mL容量瓶中，以0.02mol/LPBS（pH 8.0）定容，配制成濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L的系列溶液。

1.2.1.2OPA溶液的配制（20 g/L）

準確稱取OPA 0.5 g，在25mL容量瓶中用適量甲醇溶解后，以0.02mol/LPBS（pH 8.0）定容。

1.2.2樣品處理

新鮮柑橘手工剝皮，于50℃干燥箱中干燥，待柑橘皮恒重，粉碎過0.3mm篩，密封備用。

1.2.3最佳檢測波長的確定及線性關系考察

準確吸取5mL濃度為0.6mg/L的GSH標準溶液與100μL 20 g/LOPA溶液反應，20min后將此溶液放入熒光分光光度計中進行發射波長（EM）和激發波長（EX）的掃描。

準確吸取5mL濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L的系列標準溶液，加入100μL 20.0g/LOPA溶液，20min后測定GSH-OPA體系的熒光強度，以濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標做標準曲線。

1.2.4柑橘樣品中GSH提取

樣品加入酶（木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等比例混合，按每克樣品中加10mg復合酶）、醋酸-醋酸鈉緩沖液，恒溫水浴提取，加熱滅酶；選擇影響復合酶提取法提取效果的料液比、溫度、時間和pH 4個因素，每個因素設3個水平[9-10]，正交試驗設計見表1。

表1 因素水平表Table 1　Table factor and level

將提取液8 000 r/min離心10min，取上清液作為供試品。測定時取1 m L供試品加入0.02 mol/L PBS （pH 8.0）定容至10mL進行測定。分別吸取以上提取液5mL，加入100μL 20 g/LOPA溶液，20min后測定GSH-OPA體系的熒光強度，熒光強度越強則GSH含量越高，反之則越低。

1.2.5柑橘GSH檢測及回收率的測定

在最佳提取條件下，采用復合酶法對10種柑橘皮粉末中的GSH進行提取，按照1.2.4方法測定GSH含量；每種柑橘樣液各取3份，每份5mL，分別加入0.3mg/L的GSH標準溶液，加入100μL 20 g/L的OPA溶液，20min后測定GSH-OPA體系的熒光強度、計算回收率。

1.3數據統計與分析

數據處理、回歸分析及畫圖是使用Origin數理統計和畫圖軟件。

2　結果與討論

2.1最佳檢測波長的確定及線性關系考察

波長掃描如圖1，EX為345 nm，EM為425 nm。標準工作曲線的回歸方程為y=2 918.5x+93.279，相關系數R2=0.999 3。

圖1　激發波長及發射波長掃描光譜Fig.1　Excitation wavelength and em issionwavelength

2.2柑橘樣品GSH的提取

正交試驗結果見表2。

極差R大小為RC＞RB＞RD＞RA，即影響程度從大到小依次為：時間、溫度、pH和料液比。最佳提取條件為A3B2C3D2，即料液比1∶40（g/mL），溫度 50℃，時間90min，pH 5.0。根據最佳提取條件進行驗證試驗，測得GSH提取量為9.37mg/kg。

表2　復合酶提取法正交試驗設計及結果Table 2　O rthogonalarray design for optim izingm ulti-enzym atic extraction and test results

2.310種柑橘中GSH含量測定

10種柑橘皮GSH檢測結果及回收率見表3。

表3　10種柑橘皮中GSH的含量及回收率Table3　The contentand the recovery rateof reduced glutathione in 10Citrus peels

這10種柑橘皮GSH的提取量為（7.81±0.35）mg/kg～（13.39±0.61）mg/kg，結合GSH在自然界不同組織中的分布范圍[10]，柑橘皮中GSH的含量幾乎達到茄子、菠菜等蔬菜中的GSH含量[11-13]，柑橘果皮高于葉片中的GSH含量[14]，由結果可知也可看出，不同品種（系）柑橘皮GSH含量差異明顯。柑橘皮作為生物吸附劑對金屬離子的吸附是否與GSH有關？這一過程中可能存在一種作用方式，也可能幾種機理同時作用。

3　結論

目前對GSH的提取大多采用熱水提取法、超聲波法和化學滲透法，但提取率較低（0.145%）[15]，本課題組對熱水提取法、超聲波法、化學滲透法、復合酶法提取GSH的方法進行了比較，結果發現，復合酶法明顯提高了GSH的提取率，漢中10種柑橘皮中GSH的含量豐富。中國是柑橘生產大國，每年約有150萬t左右的果皮資源，但目前少量藥用外，大部分柑橘皮被作為垃圾丟棄。今后應加強對柑橘皮提取物的分離純化及對其生物活性化合物結構的研究；同時，還應加強柑橘皮的藥理活性研究，為進一步研究開發提供更多的理論參考。例如柑橘皮作為生物吸附劑為重金屬廢水的處理提供了一種經濟可行的技術，它的原料來源廣泛且廉價，可達到以廢治廢的效果，在此研究基礎上，今后可進一步研究柑橘中谷胱甘肽的準確定性和定量分析、分離純化及藥理活性等問題。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.013

收稿日期：2015-07-06

基金項目：陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃項目（2014JQ3113）；陜西省教育廳自然科學研究項目（14JK1158）；陜西理工學院科研基金項目（SLGKY-41）

作者簡介：蔣景龍（1980—），男（漢），講師，博士，碩士研究生導師，主要從事柑橘相關研究工作。

Study on the Compound Enzym e Extraction of Reduced Glutathione from Citrus and Determ ination by Fluorometric M ethod

JIANG Jing-long
（Schoolof BiologicalScienceand Engineering，ShaanxiUniversity of Technology，Hanzhong723001，Shaanxi，China）

Abstract：Process conditions for compound enzyme extraction of reduced glutathione（GSH）from Citrus peel was developed，with use of o-phthalaldehyde（OPA）as a fluorescent reagent and the contents of GSH was determined by fluorescence spectrophotometry.The results showed that the optimum extraction technology of GSH from CITRUS peelwasas following：ratioofsolid to liquid 1∶40（g/mL），extraction emperatureof50℃，extraction duration 90 min and pH 5.0．The yield of GSH from Citrus peel samp le under these conditions was 9.06 mg/kg．GSH was extracted from Nichinan 1，Okitsu，Shatian pummel，Yamasaki，Cumquat，Zhuhongju，Miyagawa，Fanyahuanghou，Fanyabingtangju and Chenggubingtangju by compound enzymemethod under the optimized conditions，and the contentofGSH ranged from 7.81mg/kg-13.39mg/kg.The determination of GSH proceededwith the accurateand sensitivemethod with the recovery rangeof96.7%-99.3%.

Keywords：Citrus；reduced glutathione；o-phthalaldehyde；fluorospectrophotometry