樹莓干果總黃酮純化前后活性比較

楊靜，武彥輝，劉緣曉，韓紅娟，許嬌妹，劉永平，*（.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西太原03005；2.北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京02206）

樹莓干果總黃酮純化前后活性比較

楊靜1，2，武彥輝1，劉緣曉1，韓紅娟1，許嬌妹1，劉永平1，*
（1.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西太原030051；2.北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

摘要：用超聲輔助醇法提取的樹莓干果總黃酮，再經(jīng)XDA-6大孔樹脂純化，比較純化前后藥粉中黃酮含量、抗氧化活性、抑菌活性以及菌絲生長(zhǎng)抑制率的變化。結(jié)果顯示：在50%乙醇溶解條件下，純化后黃酮含量比純化前提高了91.10%；在純化前后藥液濃度均為0.25 mg/mL時(shí)，DPPH抗氧化活性提高最多，達(dá)到13.35%；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度從純化前的藥液濃度8 mg/mL（相當(dāng)于黃酮濃度1.6 mg/mL）下降為藥液濃度2 mg/mL（相當(dāng)于黃酮濃度0.8 mg/mL）；純化前后黃酮對(duì)小麥赤霉菌和棉花枯萎菌的菌絲抑制率表現(xiàn)為低濃度下提高多，高濃度下提高少的趨勢(shì)，藥液濃度為8 mg/mL時(shí)，對(duì)棉花枯萎菌抑菌率提高幅度最小為0.6%，而藥液濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)小麥赤霉菌抑菌率提高幅度最大為44.02%，說明大孔樹脂純化后黃酮的各項(xiàng)指標(biāo)有所改善。

關(guān)鍵詞：樹莓；黃酮；抗氧化活性；抑菌活性；菌絲生長(zhǎng)抑制率

樹莓（Rubus idaeus）是薔薇科（Rasaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物，又名馬林果，覆盆子，懸鉤子、托盤等，為多年生小灌木，兼木草兩性。樹莓果實(shí)柔嫩多汁、酸甜適口，尤其富含黃酮、VC、VE、鞣花酸、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等多種抗炎、抗衰活性物質(zhì)，被美國(guó)人稱為“生命之果[1]。樹莓品種眾多，根狀莖發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，成活率高，最高可耐受我國(guó)東北和新疆地區(qū)-20℃至-40℃低溫，適合在多地推廣種植[2]。

樹莓鮮果采收期集中，果實(shí)易腐易衰，必須及時(shí)冷凍儲(chǔ)藏，而樹莓干果、果粉和其中有效成分的研究開發(fā)將減少對(duì)冷庫(kù)和快速消費(fèi)市場(chǎng)的依賴，有利于開拓樹莓的應(yīng)用前景。樹莓干果可藥食兩用，其中的黃酮含量較高，有很好的抗氧化活性和抑菌活性，具有很高的研究?jī)r(jià)值[3]。黃酮類化合物（flavonoids）又稱黃酮體、黃堿素，是高等植物所產(chǎn)生的一大類代謝次級(jí)產(chǎn)物，多年來一直是國(guó)內(nèi)外開發(fā)研究的熱點(diǎn)，目前已知5 000種，基本骨架為C6-C3-C6[3]。

1　材料和方法

1.1材料

樹莓干果：購(gòu)于太原市仁和大藥房，80℃烘干，家用萬能粉碎機(jī)粉碎至300 μm～400 μm備用；樣品成分分析中所用化學(xué)試劑均為分析純或生化試劑。

UV-9600紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；JOYN-15AL超聲儀：上海喬躍電子有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2菌種

大腸桿菌（Eschrichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcu aureus）、棉花枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）：由中北大學(xué)生物質(zhì)能源實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樹莓干果黃酮的提取純化

稱取粉碎后樹莓干果粉末50 g于300 W超聲波儀中，加入500 mL52%乙醇于50℃下進(jìn)行超聲輔助提取，提取時(shí)間45 min，重復(fù)提取1次，合并濾液真空旋蒸，靜置沉淀后取上清；一部分干燥得到黃色粉末，記為粗黃酮[4]；另一部分藥液經(jīng)XDA-6大孔樹脂純化，經(jīng)真空旋蒸干燥后得到的黃色粉末，記為純黃酮。

1.3.2純化前后黃酮含量的測(cè)定

式中：n為稀釋倍數(shù)；C為溶液中總黃酮濃度，mg/ mL；V為溶解體積，mL；m為粗黃酮藥粉重量，mg。

1.3.3抗氧化活性的測(cè)定

式中：A樣品表示試驗(yàn)樣品對(duì)DPPH作用的吸光度；A空白表示試驗(yàn)樣品自身對(duì)吸光度的貢獻(xiàn)；A對(duì)照表示DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)處的吸收度。

1.3.4培養(yǎng)基的配制

用1.3.2中黃酮含量最高的乙醇濃度配制80mg/mL母液，二倍稀釋后適量添加到無菌培養(yǎng)中，配制①LB液體培養(yǎng)基+粗黃酮（藥粉終濃度：0、1、2、4、8 mg/mL）；②LB液體培養(yǎng)基+純黃酮（藥粉終濃度：0、0.5、1、2 mg/mL）；③PDA固體培養(yǎng)基+粗黃酮（藥粉終濃度：0、1、2、4、8 mg/mL）；④PDA固體培養(yǎng)基+純黃酮（藥粉終濃度：0、1、2、4、8 mg/mL）。

1.3.5最低抑菌濃度的測(cè)定

分別接種200 μL經(jīng)活化的細(xì)菌（稀釋到濃度為1×106cfu/mL）于含有不同濃度黃酮藥粉的20 mL LB液體培養(yǎng)基中，用未加菌液的培養(yǎng)基作為每組的空白對(duì)照，每培養(yǎng)2 h吸取0.5 mL培養(yǎng)液，稀釋后（大腸桿菌稀釋4倍，金黃色葡萄球菌稀釋10倍），平行測(cè)定3組A600nm值，考慮到測(cè)定中的體積影響，每測(cè)4個(gè)點(diǎn)，更換一瓶，37℃下培養(yǎng)24 h，觀察記錄，不長(zhǎng)菌的最高藥粉濃度為最低抑菌濃度。

1.3.6真菌菌絲抑菌率測(cè)定

用6 mm內(nèi)徑的打孔器將活化好的菌落打孔取樣（3塊/皿），菌絲朝下放置于含有不同濃度黃酮藥粉的PDA固體培養(yǎng)基上，28℃下倒置培養(yǎng)48 h后測(cè)量菌絲長(zhǎng)度：

2　結(jié)果與分析

2.1不同乙醇濃度下純化前后黃酮含量變化

紅樹莓鮮果的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，除了含有多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)元素，還含有抗炎、抗衰和抗癌的黃酮、水楊酸等多種次生代謝物。其中黃酮的種類繁多，溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)（苷或苷元，單糖苷，雙糖苷或三糖苷）不同而有很大差異。以不同乙醇濃度溶解純化前后黃酮藥粉，經(jīng)比色法測(cè)定發(fā)現(xiàn)總黃酮含量隨乙醇濃度提高發(fā)生有規(guī)律的變化，結(jié)果見圖1。

圖1　不同乙醇濃度下純化前后黃酮含量變化Fig.1　Flavonoids content before and after purification at different concentration of ethanol solution

由圖1可知，隨著乙醇濃度的不斷增加，純化前后黃酮藥粉的溶解度呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，在50%乙醇濃度處溶解度最高，含量分別達(dá)到粗黃酮21.12%，純黃酮的40.36%，純度大約提高了91.10%，即1 mg/mL的粗黃酮藥粉溶液相當(dāng)于有效黃酮濃度約為0.2 mg/mL，而1 mg/mL的純黃酮藥粉溶液則相當(dāng)于有效黃酮濃度約為0.4 mg/mL；另外，純化后藥粉的黃酮含量始終高于純化前藥粉的含量。

樹莓果期集中，果實(shí)常溫下幾個(gè)小時(shí)就會(huì)失去商品價(jià)值，是最不耐保存的水果之一。就是在-18℃條件下，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)汁液流失率升高，硬度下降，花色素苷、總酚含量也逐漸下降[5]。干燥保存不僅有利于易腐水果的保存，也不利于對(duì)其提取物的保存和運(yùn)輸。樹莓干果醇提后的藥液經(jīng)過旋蒸濃縮后，溶劑乙醇含量低于5%，低溫保存也容易長(zhǎng)菌變質(zhì)；純化后的藥液用60%的乙醇濃縮近一倍，但是體積較大，所以純化前后的藥液干燥成粉是一種有效的保存、運(yùn)輸和再利用的方法。但是不同干燥方式也可能導(dǎo)致不同的組分流失，Si等[6]研究了不同的干燥方法對(duì)于樹莓果實(shí)不同次生代謝的保存效果差異，結(jié)果顯示冷凍干燥最有利于水提花色素的保留，而熱風(fēng)干燥結(jié)合紅外微波干燥法則最有利于多酚和黃酮的保留。因此根據(jù)不同的使用目的，探討研究樹莓的保存方式，有利于樹莓推廣和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

2.2純化前后黃酮抗氧化活性變化

將純化前后黃酮藥粉分別配制和稀釋成濃度為0.05、0.10、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL溶液，通過DPPH抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2　純化前后黃酮抗氧化活性變化Fig.2　Flavonoids antioxidant activity changes before and after purification

由圖2可知，純化前后藥粉濃度為2.0 mg/mL時(shí)，氧自由基清除率均超過90%，接近飽和，且它們之間差異不顯著（P<0.05）。但是，在其它被測(cè)濃度范圍內(nèi)，均表現(xiàn)為純化后的氧自由基清除率高于純化前的，差異最大值為0.25 mg/mL時(shí)，純化前為76.58%，純化后為86.81%，提高了13.35%；但是根據(jù)2.1的結(jié)果，50%乙醇溶解下，黃酮的純度提高了91.10%，遠(yuǎn)高于抗氧化活性的提高，這可能是由于醇提產(chǎn)物中其它物質(zhì)參與了氧自由基的清除，而大孔樹脂的純化并沒有相應(yīng)的富集這些物質(zhì)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)粗黃酮總蛋白的含量從（64.94±1.76）mg/g升高到純黃酮的（73.12± 0.92）mg/g，而SOD的比活則從（79.24±2.48）U/mg下降到（68.11±0.27）U/mg。

2. 3純化前后黃酮對(duì)細(xì)菌抑菌活性的影響

在不含黃酮的LB培養(yǎng)基中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌正常生長(zhǎng)，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，A600 nm值接近1.0，而在含有不同藥粉濃度培養(yǎng)基中，兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)都受到了不同程度的抑制，結(jié)果見圖3。

如圖3A、圖3C顯示兩種細(xì)菌的粗黃酮最小抑菌濃度MIC為8 mg/mL，相當(dāng)于有效黃酮濃度為1.6 mg/mL；如圖3B、圖3D顯示，純黃酮藥粉的最小抑菌濃度MIC為2 mg/mL相當(dāng)于有效黃酮濃度為0.8 mg/mL，也就是在純化后黃酮含量增加約1倍的情況下，抑菌活性提高了2倍，說明大孔樹脂純化對(duì)這兩種細(xì)菌的抑菌組分得到了更好的富集。在細(xì)菌培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)：高濃度的粗黃酮藥粉濃度（特別是8 mg/mL）由于雜質(zhì)和顆粒存在，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)吸光值有少量影響，但是幾乎保持恒定，未見細(xì)菌生長(zhǎng)；而純黃酮藥粉易溶解，無雜質(zhì)沉淀，全程不影響吸光值。

圖3 純化前后抑菌活性比較Fig.3 Comparison of antibacterial activity of flavonoids before and after purification

2.4純化前后黃酮對(duì)真菌抑菌活性的影響

小麥赤霉菌（又名禾谷鐮刀菌）和棉花枯萎菌是危害小麥和棉花正常生長(zhǎng)的真菌，黃酮添加對(duì)真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用見圖4。

圖4　粗黃酮和純黃酮對(duì)真菌菌絲的抑菌率比較Fig.4　Comparison of hyphae inhibition rate of flavonoids before and after purification

由圖4可知，純化前后不同濃度黃酮添加都能抑制菌絲生長(zhǎng)，并且隨著藥液濃度的增加對(duì)真菌菌絲的抑制作用不斷加強(qiáng)；粗黃酮和純黃酮對(duì)小麥赤霉菌的抑菌活性總體上比棉花枯萎菌的高；純黃酮抑菌活性略高于粗黃酮，但是這種差異在兩種真菌中都表現(xiàn)為隨著藥液濃度增加，差異逐漸減少的趨勢(shì)。最接近的一組是8 mg/mL的棉花枯萎菌，純化前抑制率為57.41%和純化后的58.78%，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著（P<0.05），但是數(shù)值上僅僅提高了0.6%；差異最大一組是1 mg/mL的小麥赤霉菌，純化前為20.38%，純化后是30.00%，抑制率提到了44.02%。但是，純黃酮對(duì)于真菌抑菌活性的提高遠(yuǎn)低于純黃酮對(duì)細(xì)菌抑菌活性的提高（提高了2倍，即200%）。推測(cè)由于黃酮種類眾多，大孔樹脂可能對(duì)抑制真菌的黃酮組分沒有有效富集，也有可能是粗黃酮藥粉中的其他可溶性物質(zhì)參與了真菌菌絲的生長(zhǎng)抑制。在番石榴中提取番石榴苷（一種植物黃酮）對(duì)造成齲齒的變性鏈球菌有很好的抑制作用[7]，而且在不同種植物、不同品種、甚至同一品種的不同采收期所含有的黃酮種類和成分差異巨大[8-9]，因此，進(jìn)一步借助HLPC和層析技術(shù)分析、富集樹莓果實(shí)中的不同黃酮成分，進(jìn)行更有針對(duì)性的研究，可能是解釋純化前后黃酮藥粉各項(xiàng)指標(biāo)變化的內(nèi)在原因。

3　結(jié)論

純化后的黃酮藥粉雜質(zhì)更少，溶解液更加澄清，含量從純化前的21.12%提高到純化后的41.36%，純度約增加1倍；DPPH抗氧化活性在藥粉濃度為0.25 mg/mL時(shí)提高最大，提高了13.35%；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC從粗黃酮的8 mg/mL（黃酮濃度1.6mg/mL）下降到純黃酮的2mg/mL（黃酮濃度0.8 mg/mL），抑菌活性提高了2倍；純化后黃酮對(duì)小麥赤霉菌和棉花枯萎菌的菌絲抑制率表現(xiàn)為低濃度下提高多，高濃度下提高少的趨勢(shì)，藥液濃度為8 mg/mL時(shí)，對(duì)棉花枯萎菌抑菌率提高幅度最小為0.6%，而藥液濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)小麥赤霉菌抑菌率提高幅度最大為44.02%，但是真菌菌絲抑制效率的提高遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)細(xì)菌的抑制效率的提高幅度。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.001

收稿日期：2015-08-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31200462）；山西省自然科學(xué)青年基金（2012021029-1）；北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KFK2015001）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課題（2014-2016）

作者簡(jiǎn)介：楊靜（1977—），女（白），副教授，博士，研究方向：植物生理生化。

*通信作者

Comparison Activity of Total Flavonoids from Raspberry Dry Fruit before and after Purification

YANG Jing1，2，WU Yan-hui1，LIU Yuan-xiao1，HAN Hong-juan1，XU Jiao-mei1，LIU Yong-ping1，*
（1.School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China；2.Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture P.R.China，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）

Abstract：Total flavonoids were extracted by auxiliary ultrasonic-assisted alcohol method from raspberry dry fruit，then purified through macroporous resin XDA-6.Comparison qualities of the unpurified and purified flavonoids powder include the purity，antioxidant activity，antibacterial activity and hyphae inhibition rate. Results showed that the purity of purified flavonoids dissolved by 50%alcohol increased by 91.10%，antioxidant activity of purified flavonoids increased by 13.35%at 0.25 mg/mL.The minimum inhibitory concentration（MIC）of Escherichia coli and Staphylococcus aureus droped to purified solution concentration of 2 mg/mL（the equivalent of flavonoid concentration of 0.8 mg/mL）from unpurified solution concentration of 8 mg/mL（the equivalent of flavonoid concentration of 1.6 mg/mL）.The differences of hyphae inhibition rate of flavonoids before and after purification were higher under low concentrations than under high concentrations. The minimum difference of inhibition rate of Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum was 0.6%at 8 mg/mL，while the maximum difference of inhibition rate of Fusarium graminearum was 44.02%at 1 mg/mL.Therefore，the qualities of purified flavonoids were improved after purification.

Key words：raspberry；flavonoids；antioxidant activity；antibacterial activity；hyphae inhibition rate