組培鐵皮石斛多糖對自由基清除作用的研究

唐軍榮，劉云，董燕平（西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南昆明650224）

組培鐵皮石斛多糖對自由基清除作用的研究

唐軍榮，劉云，董燕平
（西南林業(yè)大學國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南昆明650224）

摘要：采用水提法從組培鐵皮石斛中提取出多糖，研究組培鐵皮石斛中多糖對自由基的清除作用。結(jié)果表明：組培鐵皮石斛中多糖具有較強的抗氧化能力，對羥基自由基、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基（DPPH·）均具有良好的清除作用。當多糖質(zhì)量達到60 μg時，其對羥基自由基清除率能達到91.4%，對超氧陰離子自由基的抑制率最高達47.08%；當多糖質(zhì)量達到700 μg時，對DPPH·的清除率達到51.91%。因此，組培鐵皮石斛中多糖具有較強的清除自由基的作用。

關(guān)鍵詞：組培鐵皮石斛；多糖；自由基；清除作用

鐵皮石斛（D.candidum Wall.ex Lindl.）是蘭科石斛屬（Dendrobium）多年生附生草本植物[1]，是《中華人民共和國藥典》收載的5種石斛屬植物之一，主傷中、除弊、下氣、補五臟虛勞羸弱、強陰、久服厚腸胃；民間稱其為“救命仙草”[2]。多糖是石斛屬植物的主要活性成分[3]，石斛多糖具有降血糖[4]，抗腫瘤[5]，抑菌[6]等功效。人工培養(yǎng)鐵皮石斛中含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，并含有豐富的K、Ca、Mg等無機元素，具有較高的營養(yǎng)價值[7]。

采用組培鐵皮石斛苗作為材料，以組培鐵皮石斛苗中提取出的多糖為主要研究對象，對照組培鐵皮石斛苗和VC進行總還原能力、清除羥基自由基、清除超氧陰離子和清除DPPH·（1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基）能力進行測定。擬闡明這些不同樣品的抗氧化性以及清除自由基的作用效果，為進一步闡明組培鐵皮石斛苗中多糖抗氧化穩(wěn)定性的機制、開發(fā)功能性食品、藥品、保健品提供理論參考，從而進一步推進鐵皮石斛人工培養(yǎng)物在功能食品和藥品中的應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

組培鐵皮石斛苗：為云南省文山州種源。

葡萄糖（C6H12O6）、蒽酮、三吡啶三吖嗪（TPTZ）、維生素C、水楊酸、鹽酸、醋酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、硫酸、DPPH、甲醇等，均為分析純。

1.2主要儀器、設(shè)備

UV-1000紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；N1100D-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；3K15臺式冷凍高速離心機：德國SIGMA公司。

1.3方法

1.3.1組培鐵皮石斛中多糖的提取

將鐵皮石斛組培苗破碎，破碎的石斛組織于90℃、料水比1∶20的條件下回流提取1 h，重復3次，合并提取液，3 000 r/min下離心5 min，收集上層離心液，經(jīng)真空濃縮，干燥后稱重，得待測樣品，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2組培鐵皮石斛多糖含量的測定

1.3.2.1葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取經(jīng)105℃干燥恒重的標準葡萄糖0.05 g（精確到0.0001g），用溫蒸餾水溶解，并定容至1000mL。此溶液質(zhì)量濃度為50 μg/mL。分別取上述葡萄糖溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL到25 mL具塞試管中，用蒸餾水補足到2 mL；在冰水浴中加入4 mL的2 g/mL的蒽酮-硫酸溶液，搖勻，置于沸水中加熱煮沸5 min，取出后用流動水冷卻至室溫，以零管為空白，于625 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，對應(yīng)吸光值為縱坐標建立標準曲線，如圖1所示。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　The standard curve of glucose

1.3.2.2組培鐵皮石斛多糖含量的測定

取樣品的儲備液（50 μg/mL）1.6 mL到25 mL具塞試管中，用蒸餾水補足到2 mL；在冰水浴中加入4 mL 的2 g/mL的蒽酮-硫酸溶液，搖勻，置于沸水中加熱煮沸5 min，取出后用流動水冷卻至室溫，以葡萄糖樣品中零管為空白，于625 nm處測定吸光度。由標準曲線求得對應(yīng)的多糖濃度，以葡萄糖計。

1.3.3FRAP法測定組培鐵皮石斛多糖的總抗氧化能力[8]

1.3.3.1硫酸亞鐵標準曲線的繪制

FRAP工作液的配制：用40 mmol/L鹽酸溶液溶解，配成1.6 mmol/LTPTZ，配制pH3.6的醋酸鹽緩沖液300 mmol/L和20 mmol/L FeCl3溶液。3者以1∶100∶1的比例混合配成工作液。

取不同體積5 μL～140 μL的1mmol/L FeSO4溶液，用蒸餾水補足至2mL，再加入配制好的FRAP工作液3 mL，混勻后于37℃反應(yīng)30 min，在593 nm下測定樣品液的吸光度值，確定還原力標準曲線，如圖2所示。

圖2 還原力標準曲線Fig.2　The standard curve of reduntion force

1.3.3.2組培鐵皮石斛多糖總抗氧化能力的測定

精密稱取樣品質(zhì)量50 μg～300 μg的待測樣品加入到有刻度試管中，加蒸餾水至2 mL，再加入FRAP工作液3 mL，混勻后于37℃反應(yīng)30 min，取出后立即在593 nm處測定吸光度。以不加樣品組為參照，測定樣品吸光度值，每個樣品平行測3次，取平均值。根據(jù)還原力標準曲線，計算相同吸光度值的FeSO4當量濃度，記為FRAP值。

1.3.4組培鐵皮石斛多糖清除羥基自由基的能力

根據(jù)Fenton反應(yīng)的方法，建立·OH產(chǎn)生體系模型。采用固定反應(yīng)時間法，并與無·OH的空白組比較，便能測定被測物·OH的清除能力[9]。在刻度試管中加入5mL的蒸餾水，30 μL的0.02mol/L的FeSO4，100 μL 0.01 mol/L水楊酸，最后加入25 μL 0.02 mol/L H2O2啟動反應(yīng)，放置37℃水浴保溫反應(yīng)30 min，之后立即在510 nm處測定吸光度，作為空白吸光度值。同上，在刻度試管中分別加入不同系列5 μg～60 μg的樣品后，再加入25 μL 0.02 mol/L H2O2啟動反應(yīng)，水浴恒溫30min，之后測定吸光度值作為加樣品后吸光度值[10]。

清除率/%=[（A1-A0）/A0]×100

式中：A1為加入待測物后的吸光值；A0為空白對照的吸光值。

1.3.5組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子自由基的能力

以改良鄰苯三酚自氧化的速率來表示抑制超氧陰離子自由基的能力[11]

加入樣品前：將pH8.2Tris-HCl緩沖液和50mmol/L鄰苯三酚在25℃的恒溫水浴鍋中保溫，取5 mLpH 8.2Tris-HCl緩沖液，加30 μL 50 mmol/L鄰苯三酚，搖勻，在325 nm下立即測定。以pH8.2Tris-HCl緩沖液為空白，每隔0.5分鐘測一次吸光值，計算出平均值A(chǔ)0。

加入樣品后：取5 mL pH8.2Tris-HCl緩沖液，加待測樣品5 μg～60 μg、30 μL 50 mmol/L鄰苯三酚，搖勻，立即同上測定。以pH8.2Tris-HCl緩沖液為空白，每隔0.5 min測一次吸光值，計算出平均值A(chǔ)1。

抑制率/%=[（A0-A1）/A0]×100

式中：A1為加入待測物后的吸光值；A0為空白對照的吸光值。

1.3.6組培鐵皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力[12]

1.3.6.1DPPH標準曲線的繪制

精密稱取DPPH0.020 2 g，加甲醇溶解，定容至50 mL，作為儲備液。精密移取上述儲備液10 mL至100 mL容量瓶中，定容得40.4 mg/L的儲備液，備用。分別精密移取DPPH儲備液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL刻度試管中，用甲醇定容至刻度，搖勻，以甲醇溶劑作參比，在515 nm處測定各溶液的吸光度。以DPPH的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，如圖3所示。

圖3DPPH標準曲線Fig.3　The standard curve of DPPH

1.3.6.2組培鐵皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力

分別在1.0 mL DPPH儲備液中加入不同質(zhì)量（200 μg～800 μg）樣品待測物，用甲醇稀釋至總體積為3.00 mL，混勻放置40 min后，用1 cm比色皿于515 nm處測定吸光度，根據(jù)DPPH標準曲線回歸方程計算DPPH質(zhì)量濃度，按下列公式計算DPPH·清除率（Y）。

式中：C0為反應(yīng)體系中DPPH的起始質(zhì)量濃度，mg/L；Ct為40min后反應(yīng)體系中DPPH的質(zhì)量濃度，mg/L。

2　結(jié)果與分析

2.1組培鐵皮石斛多糖的含量

經(jīng)過測定，由水提取法浸提組培鐵皮石斛苗，所得到的組培鐵皮石斛多糖及組培鐵皮石斛苗中多糖的含量分別為73.15%和10.51%。

2.2組培鐵皮石斛多糖的總抗氧化能力

通過FRAP法，3種不同樣品總抗氧化的能力見圖4所示。

圖4FRAP法測定不同樣品的還原力Fig.4　The reduction force of different samples determined by FRAP method

由圖4可知，當樣品加入量在50 μg～300 μg范圍時，隨著組培鐵皮石斛多糖、組培鐵皮石斛苗及VC加入量的增加，其總抗氧化的能力也隨之增強。組培鐵皮石斛苗的抗氧化能力最弱，組培石斛多糖抗氧化能力相對較強，而VC的總抗氧化能力優(yōu)于組培鐵皮石斛苗。總體說來組培鐵皮石斛多糖的總抗氧化能力明顯比組培鐵皮石斛苗強得多。

2.3組培鐵皮石斛多糖清除羥基自由基的能力

依據(jù)Fenton反應(yīng)體系建立的清除羥基自由基能力，其結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同樣品對·OH清除作用Fig.5　The scavenging effects to·OH with different samples

由圖5可知，組培鐵皮石斛多糖對羥基自由基清除能力高于其余樣品，VC對羥基自由基清除能力相對較低，而組培鐵皮石斛苗對羥基自由基清除能力最低。由此可知，組培鐵皮石斛多糖對羥基自由基清除能力較高，而組培鐵皮石斛苗對羥基自由基清除能力相對較弱。

2. 4組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子能力

不同樣品抑制超氧陰離子能力如圖6所示。

由圖6可知，3種不同物質(zhì)都具有一定的抑制超氧陰離子自由基的能力。隨著樣品含量的增加，樣品抑制超氧陰離子自由基的能力不斷增強。組培鐵皮石斛苗抑制超氧陰離子自由基的能力相對較弱，當樣品加量為10 μg時，對超氧陰離子自由基的抑制率僅為3.48%，加樣量增大到60μg時，抑制率也僅為23.47%；組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子自由基能力相對較強，即當樣品質(zhì)量均增加到60 μg時，組培鐵皮石斛多糖抑制超氧陰離子自由基能力達到了47.08%，VC次之，抑制超氧陰離子自由基能力達到了44.19%。

圖6　不同樣品對·O2-抑制作用Fig.6　The inhibition effects to·O2-with different samples

2.5組培鐵皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力

組培鐵皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力見圖7。

圖7不同樣品對DPPH·的清除作用Fig.7　The scavenging effects to DPPH·with different samples

由圖7可知，隨著反應(yīng)體系中加入組培鐵皮石斛多糖、組培鐵皮石斛苗及VC的質(zhì)量愈大，其清除DPPH自由基的能力愈強。對不同樣品物質(zhì)所表現(xiàn)出來的清除DPPH自由基的能力有所不同。試驗結(jié)果表明，組培鐵皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力相對較強，當石斛多糖質(zhì)量為700 μg時，組培鐵皮石斛多糖清除率達到51.91%，而其他兩個樣品對DPPH·的清除率效果均低于組培鐵皮石斛多糖。

3　結(jié)論

試驗結(jié)果表明，與組培鐵皮石斛苗和VC相比較，組培鐵皮石斛苗經(jīng)水提法浸提得到的組培鐵皮石斛多糖具有較強的總抗氧化能力及羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力，且均是隨著多糖質(zhì)量的增大而增強。當組培鐵皮石斛加入質(zhì)量達到60 μg時，對羥基自由基的清除率達到91.40%；當組培鐵皮石斛加入質(zhì)量達到10 μg以上時，對超氧陰離子自由基的抑制率達到22.12%以上；當組培鐵皮石斛加入質(zhì)量增大到700 μg時，對DPPH自由基的清除率達到51.91%?？梢姡M培鐵皮石斛多糖具有較強的清除自由基的作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.004

收稿日期：2014-03-17

基金項目：云南省教育廳科學研究基金（2013Y123）

作者簡介：唐軍榮（1982—），男（漢），講師，碩士，主要從事藥用植物的繁育研究。

Study on the Free Radicals Scavenging Effects of Polysaccharides in Tissue Culturing Seedlings of Dendrobium Candidum

TANG Jun-rong，LIU Yun，DONG Yan-ping
（Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China of State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan，China）

Abstract：Water extraction method was used to extract polysaccharides from tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum，and the scavenging effects of polysaccharides in tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum on free radicals were studied.The results indicated that polysaccharides extracted from tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum had remarkable antioxidative activity，and exhibited satisfactory scavenging effects on·OH and·O2-and DPPH·.The scavenging rates on·OH and·O2-were 91.4% and 47.08%when polysaccharides quality was 60 μg；the scavenging rates on DPPH·was 51.91%when polysaccharides quality was 700 μg.The ability of free radicals scavenging of polysaccharides in tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum was good.

Key words：tissue culturing seedlings of Dendrobium Candidum；polysaccharides；free radical；scavenging effects