高密度雙菌型復合微生態制劑發酵條件的研究

張恒慧，續繁星，李曉宇，任曉莉，王曉麗，徐永平，5，*（.太原工業學院，山西太原00008；2.大連理工大學，遼寧大連6024；.沈陽藥科大學，遼寧沈陽006；4.大連理工大學動物性食品安全保障技術教育部工程研究中心，遼寧大連6600；5.大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧大連6600）

高密度雙菌型復合微生態制劑發酵條件的研究

張恒慧1，2，續繁星3，李曉宇2，4，任曉莉1，王曉麗1，徐永平2，4，5，*
（1.太原工業學院，山西太原030008；2.大連理工大學，遼寧大連116024；3.沈陽藥科大學，遼寧沈陽110016；4.大連理工大學動物性食品安全保障技術教育部工程研究中心，遼寧大連116600；5.大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧大連116600）

摘要：通過單因素試驗分別研究初始pH、培養溫度、接種量等因素對凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌生長的影響，隨后通過正交試驗對發酵條件進行優化。結果表明：雙菌型復合微生態制劑的最優發酵條件為凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的菌種配比1∶2，培養溫度37℃，初始pH 6.8，接種量4%。在此最優發酵條件下，復合微生態制劑發酵菌體濃度達7.75×109cfu/mL。

關鍵詞：凝結芽孢桿菌；嗜酸乳桿菌；復合微生態制劑；發酵條件

微生態制劑是一類可通過調節機體腸道菌群平衡來抑制腸道病原菌或促進機體健康從而對機體產生有利影響的活菌制劑[1]。微生態制劑能夠調節動物腸道功能紊亂、提高動物機體免疫力，相比較抗生素的抑菌作用，可以有效避免耐藥性、藥物殘留、和二重污染等副作用[2-4]。目前微生態制劑制品以單菌型微生態制劑研究較多，而且以發酵乳居多，其他營養物的發酵產品較少，如凝結芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌益生菌等的發酵乳制劑[5-7]。然而檢驗微生態制劑發酵結果的重要指標就是發酵液中的活菌數，如何提高發酵液中活菌數是微生態制劑發酵條件研究的重點之一。

動物腸道是一個多菌生長的復雜環境，正常情況下，多種益生菌協調生長，各自最適生長條件又不完全相同，在一定范圍內可能發揮著接力益生作用[8]。芽孢桿菌類益生菌（如凝結芽孢桿菌）為好氧繁殖，進入人和動物腸道內能消耗大量的游離氧，并在腸道內定植，降低氧化還原電勢，有利于腸道內厭氧微生物細菌如乳酸菌、雙歧桿菌的生長；嗜酸乳桿菌是兼性厭氧菌，耐熱性差，耐酸性較強，能在其他乳酸菌不能生長的環境中（低pH，高膽鹽）生長繁殖[9-11]。因此，多菌型微生態制劑在發酵培養過程中可以較長時間保持一個比較高的活菌濃度，對環境變化（如產酸pH變化）的適應更強，最終發酵液能保持一個更長時期的高活菌濃度。

本文主要研究發酵條件（溫度、初始pH、接種量、菌種配比）對雙菌型復合微生態制劑活菌濃度的影響，并且設計正交試驗進一步優化發酵條件，對高活菌數復合微生態制劑的制備進行初步探索，同時為不同益生菌接力發揮益生作用的理論提供初步研究依據，為進一步大規模優化發酵條件提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種

凝結芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌：太原工業學院微生物實驗室保藏。

1.1.2材料與試劑

胰蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；BL培養基、MRS培養基：青島高科園海博生物技術有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇、濃鹽酸、瓊脂粉、EDTA、甘油等：均為分析純。

1.1.3儀器與設備

SW-C1-LED型超潔凈工作臺、BPX-52型生化培養箱、YXQ—LS—18SI型高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；AY220型電子天平：日本島津制作所；MP512-01型精密pH計：上海三信儀表廠；752N型紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器公司；101型電熱鼓風干燥器：北京市光明醫療器械廠；OLYMPUS光學顯微鏡。

1.1.4培養基與種子的制備

活化培養基為10%脫脂乳：脫脂乳粉100 g加蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，備用。

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.04 g，吐溫80 1.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，備用。

BL瓊脂培養基：肝浸粉4.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉浸粉3.0 g，胰酪蛋白胨5.0 g，可溶性淀粉0.5 g，L-半胱氨酸0.5 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，磷酸氫二鉀1.0g，大豆胨3.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸亞鐵0.01g，氯化鈉0.01 g，瓊脂20.0 g，硫酸錳0.006 7 g，吐溫80 1.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，備用。

MRS瓊脂培養基：1 000 mL MRS液體培養基加入14.0 g瓊脂粉。

1.2方法

1.2.1菌種活化、傳代、純化和擴培

將實驗室甘油冷凍保藏的凝結芽孢桿菌用10%的滅菌脫脂乳活化3次，活化溫度為37℃，涂布接種于BL瓊脂培養基，37℃培養12 h～16h，長出單個菌落擴培后再涂布接種于MRS瓊脂培養基，37℃培養12 h～16 h，待長出單個菌落，隨機挑取半數單菌落進行革蘭氏染色鏡檢，確定是否純種；挑取確認純種的菌落接種到MRS液體培養基上進行擴培。取實驗室保藏的嗜酸乳桿菌按照上述操作，獲得純種擴培菌液。

1.2.2種子液的制備

分別將凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的活化擴培菌液接種于種子培養基（MRS液體培養基），于37℃生化培養箱培養16 h。

1.2.3菌液濃度與OD值標準曲線的繪制

凝結芽孢桿菌種子液接種于滅菌MRS液體培養基中，于37℃下培養，培養2 h后每隔2 h取發酵液作觀測點，共取5個點；將每個點的發酵液稀釋適當倍數后涂布于MRS瓊脂平板，每組取3個平行，37℃培養待平板長出單菌落進行計數；同時以空白MRS培養基為對照調零，在600 nm波長下測取各點對應的OD值；根據平板計數法得到的菌濃度和對應的吸光度值便可繪制出細菌生長的OD標準曲線。采用嗜酸乳桿菌重復上述步驟，繪制嗜酸乳桿菌生長的OD標準曲線。

1.2.4復合微生態制劑發酵的單因素試驗

1）測定兩種菌生長曲線

將活化的凝結芽孢桿菌種子液以3%的接種量于體積恒定、pH為7.0的MRS液體培養基中，37℃培養，分別隔1、2、3、4、6、8、10、12、14 h測定其在波長為600 nm處的光密度。以時間為橫坐標，OD600為縱坐標繪制生長曲線。依上述試驗操作，測定嗜酸乳桿菌的生長曲線。

2）測定最適初始pH

配制所需pH的MRS液體培養基的滅菌備用，每個pH做3個試管平行對照，每管裝10 mL；將活化的菌種以3%接種量接種于試管；37℃培養12 h，以相應pH的MRS液體培養基做空白對照，測定其在600 nm處的OD值。設置初始pH：凝結芽孢桿菌pH設為6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5；嗜酸乳桿菌pH設為4.5、5.0、5.6、5.8、6.0、6.5。

3）測定最適溫度

將MRS液體培養基分裝（每支試管10 mL），115℃，20 min滅菌后，以3%的接種量接入待測菌種；培養溫度分別設置為31、34、37、40、43、46℃，每個溫度作3個平行，培養12 h后測定菌液OD值。

4）測定最適接種量

凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌分別按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量將活化的菌種接種于10 mL滅菌MRS液體培養基，每個梯度做3個平行，37℃培養12 h，測定發酵液OD值。

1.2.5正交試驗設計對復合微生態制劑發酵條件的優化

采用正交試驗法優化復合微生態制劑的發酵條件，確定單因素試驗中影響比較大的兩種菌配比、培養溫度、初始pH為試驗因素，設計設計L9（34）正交試驗，以獲取雙菌型復合微生態制劑的最佳發酵條件，具體影響因素、添加水平及各因素間不同水平組合試驗設計見表1，對正交試驗結果進行直觀分析，優化發酵條件。

表1　發酵條件正交試驗的因素和水平設計Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment

2　結果與分析

2.1菌液濃度OD標準曲線

菌液濃度是檢驗乳酸菌發酵結果的重要指標，利用菌液濃度和OD值的正比例關系，可以將菌液濃度的測定轉換為菌液OD值的測定。制作菌液濃度的OD標準曲線，可以快速獲得菌液濃度。凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的OD標準曲線測定結果見圖1和圖2。

圖1 凝結芽孢桿菌OD標準曲線Fig.1　OD standard curve of Bacillus coagulans

圖2 嗜酸乳桿菌OD標準曲線Fig.2　OD standard curve of Lactobacillus acidophilus

其中凝結芽孢桿菌標曲擬合方程為y=3.531 8x+ 3.997 7，R2=0.994 2，嗜酸乳桿菌標曲擬合方程為y= 1.86x+6.832 1，R2=0.992 6，線性擬合良好。

2.2乳酸菌生長曲線

研究生長曲線，可以分清楚乳酸菌4個生長時期，選取對數生長期的種子液進行接種，同時研究乳酸菌生長達到穩定期的培養時間，培養時間對凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌生長的影響見圖3和圖4。

圖3　凝結芽孢桿菌生長曲線Fig.3　Growth curve of Bacillus coagulans

圖4 嗜酸乳桿菌生長曲線Fig.4　Growth curve of Lactobacillus acidophilus

如圖3所示，凝結芽孢桿菌生長0～3 h為延遲期，3 h～12 h為對數期，12 h以后趨于平穩；如圖4所示，嗜酸乳桿菌生長0～4 h為延遲期，4 h～12 h為對數期，12 h達到穩定期趨于平緩。

2.3初始pH對乳酸菌生長的影響

乳酸菌細胞對環境pH非常敏感，不同種乳酸菌細胞內代謝有所差異，其最適pH也有所不同。本試驗分別研究了初始pH對兩種乳酸菌生長的影響，試驗結果見圖5和圖6。

圖5　初始pH對凝結芽孢桿菌生長的影響Fig.5　Effect of initial pH value on the growth of Bacillus coagulans

圖6　初始pH對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.6　Effect of initial pH value on the growth of Lactobacillus acidophilus

從圖中結果看出，凝結芽孢桿菌的初始pH為7.0時，發酵液活菌數最高；嗜酸乳桿菌初始pH為6.0時，發酵液活菌數最高。

2.4溫度對乳酸菌生長的影響

不同乳酸菌的最適生長溫度在一定范圍內有所差異，本試驗分別研究了不同發酵溫度對兩種乳酸菌生長的影響，試驗結果見圖7和圖8。

圖7　溫度對凝結芽孢桿菌生長的影響Fig.7　Effect of temperature on the growth of Bacillus coagulans

圖8　溫度對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.8　Effect of temperature on the growth of Lactobacillus acidophilus

由圖中可以看出，凝結芽孢桿菌在37℃～40℃之間的活菌濃度都比較高，最適生長溫度為38℃；嗜酸乳桿菌在37℃時活菌濃度明顯較高，最適生長溫度為37℃。

2.5接種量對乳酸菌生長的影響

試驗研究了不同接種量對兩種乳酸菌生長的影響，試驗結果見圖9和圖10。

圖9　接種量對凝結芽孢桿菌生長的影響Fig.9　Effect of inoculating quanity on the growth of Bacillus coagulans

圖10　接種量對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.10　Effect of inoculating quanity on the growth of Lactobacillus acidophilus

從圖中可以看出接種量的不同對發酵液的活菌數有一定的影響，凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌都以4%的接種量獲得的活菌數最高。當接種量從較低水平提高時，發酵液活菌數呈上升趨勢，當接種量超過4%，發酵液活菌數有所下降，可能是接種量大，后期由于營養缺乏導致部分菌體死亡。綜合考慮種子液的使用量和活菌數的含量，選擇4%的接種量為宜。

2.6復合微生態制劑發酵條件的優化

雙菌型復合微生態制劑發酵條件的正交優化試驗設計及結果見表2。

表2　發酵條件正交優化試驗安排、結果及直觀分析Table 2　The arrangement，results and direct analysis of orthogonal experiment

由表2極差分析可知，影響雙菌型微生態制劑發酵活菌數因素主次關系為：A>B>C，最優方案為A3B1C3。對應的發酵條件為：凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的菌種配比為1∶2；培養溫度為37℃；初始pH為6.8。在此最優發酵條件下，復合微生態制劑發酵菌體濃度達7.75×109cfu/mL。

3　結論

通過發酵條件單因素和正交試驗確定該復合微生態制劑的最優發酵條件，即凝結芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的菌種配比為1∶2；培養溫度為37℃；初始pH 為6.8；接種量4%。在此最優發酵條件下，復合微生態制劑發酵菌體濃度達7.75×109cfu/mL。相比較文獻中記錄的以及試驗中的單菌型微生態制劑的活菌濃度有所提高。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.041

收稿日期：2015-08-12

基金項目：太原工業學院校重點科研項目（2014LQ01）

作者簡介：張恒慧（1988—），男（漢），助教，碩士，從事微生態制劑及動物腸道性疾病防治研究。

*通信作者

Study on High Cell Density Culture of Compound Bi-Probiotics

ZHANG Heng-hui1，2，XU Fan-xing3，LI Xiao-yu2，4，REN Xiao-li1，WANG Xiao-li1，XU Yong-ping2，4，5，*
（1.Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，Shanxi，China；2.Dalian University of Technology，Dalian 116024，Liaoning，China；3.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，Liaoning，China；4.Center for Food Safety of Animal Origin，Ministry of Education，Dalian University of Technology，Dalian 116600，Liaoning，China；5.SEM Bio-Engineering Technology Co.Ltd.，Dalian 116600，Liaoning，China）

Abstract：This paper mainly studied the high cell density culture conditions of compound probiotics with Bacillus coagulans and Lactobacillus acidophilus.In single factor trials，initial pH value，temperature，inoculating quanity were taken as considered factors.The optimal culturing conditions obtained from the orthogonal experiment were：mixture ratio（Bacillus coagulans∶Lactobacillus acidophilus）1∶2，temperature 37℃，initial pH 6.8，inoculating quanity 4%.With the optimal conditions，the cell density of compound probiotics could reach as high as 7.75×109cfu/mL.

Key words：Bacillus coagulans；Lactobacillus acidophilus；compound probiotics；fermentation conditions