單次、分次照射與125 I粒子低劑量率照射對人喉鱗癌Hep2細胞的抑制作用

黃鸝 劉敬佳 杜立法 曲昂 趙勇 王俊杰# 張建國 張杰

1北京大學第三醫院腫瘤治療中心北京大學近距離治療中心，北京100191

2中國科學院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點實驗室，北京100101 3北京大學口腔醫院口腔頜面外科，北京100081

單次、分次照射與125I粒子低劑量率照射對人喉鱗癌Hep2細胞的抑制作用

黃鸝1劉敬佳1杜立法1曲昂1趙勇2王俊杰1#張建國3張杰3

1北京大學第三醫院腫瘤治療中心北京大學近距離治療中心，北京100191

2中國科學院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點實驗室，北京1001013北京大學口腔醫院口腔頜面外科，北京100081

目的探討125I粒子持續低劑量率照射與分次照射、單次照射對人喉鱗癌細胞Hep2的抑制作用及其作用機制。方法實驗分為無照射對照組（Ctrl組）、單次照射組（SDR組）、分次照射組（FDR組）和125I粒子持續低劑量率照射組（125I-CLDR組）四組。采用細胞克隆形成實驗法檢測Hep2細胞在不同照射條件下細胞克隆的形成能力；用流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期阻滯情況；用蛋白印跡法檢測不同照射條件后Hep2細胞總γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3蛋白表達的變化。結果經2 Gy、4 Gy、6 Gy的劑量照射，125I-CLDR組Hep2細胞克隆形成率均低于SDR組和FDR組。經4 Gy的劑量照射后，125I-CLDR組Hep2細胞出現G2/M期阻滯，且阻滯效應較SDR組及FDR組的細胞強；125I-CLDR組Hep2細胞的凋亡比例明顯高于SDR組及FDR組；三個照射組γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3、NF-κB、P21和Cdk1的表達水平上調，125I-CLDR組p-Cdc25c蛋白表達水平低于SDR組和FDR組。結論在本實驗條件下，125I粒子持續低劑量率照射較單次照射、分次照射能夠誘發更多Hep2細胞出現DNA損傷、引起持續的G2/M期阻滯、誘導細胞凋亡并抑制細胞的再增殖。

125I粒子；低劑量率照射；Hep2細胞；DNA損傷；細胞周期

Oncol Prog，2015，13(1)

放射治療是治療喉鱗癌的標準手段之一[1]。放射治療包括體外照射和體內照射，其中體外照射按照射距離又可分為遠距離照射和近距離照射。近距離照射主要包括組織間照射、腔內或管內照射、模照射及術中放置導管的照射，而放射性粒子組織間近距離放療技術是將放射性同位素直接植入腫瘤內，屬于組織間照射。在臨床上，近距離照射治療既可以單獨用于治療喉鱗癌，也可與遠距離照射治療相互補充；特別是對局部復發的腫瘤，放射性粒子組織間近距離放療更具優勢[2-6]。放射性粒子組織間近距離放療可在腫瘤局部獲得更高的照射劑量，而對周圍正常組織的損傷更小，具有更微創和患者更易接受的優勢。本實驗擬從細胞和分子水平揭示125I粒子持續低劑量率照射與單次高劑量率照射、分次高劑量率照射對喉鱗癌Hep2細胞的抑制作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人喉鱗癌細胞Hep2采用含10%胎牛血清的RPM I1640培養基于37℃、5%的CO2培養箱中培養。

對數生長期的細胞，經胰酶-EDTA消化制成單細胞懸液，被種植于35mm的培養皿中，細胞貼壁24 h后進行照射。

1.2 實驗分組

實驗分為4組：無照射對照組（control group，Ctrl組）、單次高劑量率照射組（high dose rate single dose radiation group，SDR組）、分次高劑量率照射 組（high dose rate fractionated dose radiation group，FDR組）、125I粒子持續低劑量率照射組（iodine-125 seeds continuous low dose rate radiation group，125I-CLDR組），每組設置3個平行樣。

1.3 照射方式

125I-CLDR組采用粒子照射模型[7-8]。模型分上下兩層，均由聚丙乙烯材料制成。下層為粒子板，有6個照射單元。每個照射單元的直徑均為34mm，在其圓周上等距離排列了14個粒子槽，其內放置初始活度為92.5MBq（2.5mCi）的125I粒子源（購自中國同輻股份有限公司）。上層為培養板，與粒子板照射單元相對應的位置上放置35 mm的培養皿。照射時，培養皿及粒子照射模型被放置于鉛盒內進行防護。隨后將鉛盒放在培養箱（37℃，5% CO2）內，并持續照射培養。粒子照射的初始劑量率為2.77 cGy/h；照射劑量在2Gy、4Gy、6Gy時分別需要73.6 h、150.0 h和229.4 h。高劑量率照射時，使用RS2000 X-ray生物輻射儀（購自美國Rad Source Technologies公司），其劑量率為6312 cGy/h。單次照射組為一次照射完成總劑量；分次照射組每24 h接受照射一次，每次的照射劑量為2Gy。

1.4 檢測方法

1.4.1 細胞克隆形成實驗 取一定數量的Hep2活細胞種植于35mm培養皿中，24 h后對其進行照射，完成2 Gy、4 Gy、6 Gy劑量的照射后，繼續培養。設開始種植細胞的日期為第1天，至第14天時，將各組細胞用甲醇固定10m in，瑞氏-吉姆薩染色液染色5m in，隨后在常規顯微鏡下計數克隆數。以大于50個細胞為1個克隆，并計算克隆形成率（plating efficiency，PE）及臨床常用照射劑量2 Gy的存活分數（survival fraction at 2 grey，SF2）。此外，PE的計算公式為：（克隆數/細胞接種數）×100%；SF2的計算公式為：（照射組PE/對照組PE）×100%。

1.4.2 細胞凋亡的檢測 照射4 Gy后的第24 h、48 h和72 h，分別消化4組細胞并均制成濃度為每毫升5×105個的單細胞懸液。取1m l的細胞懸液，用PBS（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）清洗2遍后，再用200μl染液（其中Annexin V-FITC 5μl，Binding Buffer 195μl；購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司）避光室溫孵育15m in。用1m l PBS洗1遍，并經400μl PBS重懸，加入10μl碘化丙啶（PI，1μg/m l；購自美國Sigma公司）后用流式細胞儀（型號為FACScan，購自美國Becton Dickinson公司）進行細胞凋亡的檢測。檢測時，Annexin V-FITC陽性細胞為凋亡細胞。

1.4.3 細胞周期的檢測 4 Gy劑量照射后的第24 h、48 h和72 h，分別消化4組細胞并均制成濃度為每毫升5×105個的單細胞懸液。取1m l的細胞懸液，用預冷的PBS清洗2遍，預冷的2m l 75%酒精予以固定，然后置于4℃冰箱過夜。PBS洗2遍洗去殘余酒精，300μl PBS重懸細胞，加入PI和RNaseA至終濃度50 ug/m l，37℃水浴避光孵育30 min。隨后用流式細胞儀（型號為FACSCalibur，購自美國Becton Dickinson公司）進行細胞周期的檢測，結果用ModFitLT 2.0軟件進行分析。

1.4.4 相關蛋白表達量的檢測 4 Gy劑量照射后，4組細胞均于第24 h、48 h和72 h三個時間點被分別提取總蛋白。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白樣品，電泳后用PVDF膜進行轉膜。5% TBST脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗于4℃下孵育過夜，TBST液洗滌3遍，再加入二抗于室溫下孵育1 h，TBST液洗滌3遍，最后進行顯影。用蛋白印跡法檢測γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3、p-Cdc25c、Cdk1、P21和NF-κB的表達情況。

1.5 統計學處理

每個實驗重復2～3次，數據以均數±標準差來表示。以Graphpad prism 5.0軟件進行統計學處理，采用t檢驗或雙因素方差分析比較組間差異。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同照射劑量對四組Hep2細胞克隆形成的抑制作用

細胞克隆形成實驗結果表明：在2 Gy、4 Gy、6 Gy的照射劑量下，不同的照射方式對Hep2細胞克隆形成的抑制能力不同，其中125I-CLDR組的Hep2細胞克隆形成受到的抑制最強；Ctrl組不接受2 Gy的劑量照射，125I-CLDR組的SF2為0.27，SDR組的SF2為0.34，FDR組為分次照射，每天僅接受一次2 Gy的照射，故其SF2與SDR組的SF2是一致。只有6 Gy的劑量照射后，125I-CLDR組的PE值對比SDR組的和FDR組的才具有統計學意義（均P＜0.05，表1）。

表1 四組細胞在不同照射劑量下的PE（%）

2.2 4Gy照射劑量下四組Hep2細胞凋亡情況

以4 Gy劑量照射后，與Ctrl組相比，其他三組第24 h、48 h、72 h的細胞凋亡率均增高；其中125ICLDR組相同照射條件下的細胞凋亡率顯著高于SDR組和FDR組，組間差異均具有統計學意義（均P＜0.05，表2）。

表2 各組在4Gy的照射劑量下不同時間節點測得的細胞凋亡率（%）

2.3 4Gy照射劑量對Hep2細胞周期的影響

與Ctrl組相比，4 Gy劑量照射后，其他三組在第24 h、48 h和72 h的G1期細胞比例均下降，G2/M期細胞比例均增加；其中125I-CLDR組在各時間節點下以G1期細胞比例下降得最明顯，G2/M期細胞比例增加得最明顯（圖1）。

2.4 4Gy照射劑量對相關蛋白表達的影響

在4 Gy的照射劑量下，與Ctrl組相比，以β-Actin為內參，其他三組細胞24 h、48 h、72 h三個時間節點檢測到的γ-H2AX、Caspase3和CyclinB1蛋白的表達水平均明顯增加；其中125I-CLDR組γ-H2AX的表達水平高于FDR組，其CyclinB1的表達水平也呈現出同樣的趨勢（圖2）。與Ctrl組相比，以β-Actin為內參，其他三組細胞的NF-κB、P21的表達水平上調，FDR組和125I-CLDR組這兩種蛋白的表達水平均高于SDR組的；125I-CLDR組Cdk1表達水平上調最明顯，但其p-Cdc25c的表達水平低于FDR組和SDR組（圖3）。

3 討論

大部分喉鱗癌患者在臨床診斷時就處于Ⅲ期或Ⅳ期，治愈率低于30%。晚期喉鱗癌患者需要手術、放療和化療等綜合治療，盡管這些治療手段有很大的改進和提高，但是在過去30年中，喉鱗癌患者的長期生存率并沒有實質性的進展，其5年生存率僅為30%～40%[9]。

125I放射性粒子治療喉鱗癌受到中國學者的廣泛證實和驗證，大量報道均明確此方法具有微創、局部劑量高和損傷小的優勢[2-6，10]。單次粒子照射可引起細胞的DNA損傷，出現細胞周期的阻滯，從而啟動細胞修復機制。如果DNA的損傷能被完全修復，則可以繼續細胞周期進程；如果不能被修復，則可能誘導細胞的凋亡。有研究顯示，輻射可引起DNA雙鏈斷裂，組蛋白H2AX磷酸化可形成γ-H2AX，其常聚集于DNA雙鏈斷裂的位點或其附近[11]。本研究中，以4 Gy的劑量照射后，Hep2細胞的γ-H2AX表達水平明顯上調，與文獻報道一致。但是關于喉鱗癌在持續低劑量率照射條件下的放射生物學效應鮮有報道。本研究中，γ-H2AX蛋白的表達水平在三個照射組中均較對照組明顯升高。克隆形成實驗結果表明，在2 Gy、4 Gy、6 Gy劑量的照射下，125I-CLDR組Hep2細胞克隆形成能力的抑制作用最強。克隆形成的實驗為臨床療效的證明提供了基礎，同時也支持了γ-H2AX表達的實驗結果。

Ma等[12]和Yang等[13]在對125I粒子治療腫瘤所進行的研究中發現，輻射后細胞的凋亡率明顯增加。在本研究中，125I-CLDR組Hep2細胞完成4 Gy照射后24 h、48 h、72 h的凋亡率較SDR組、FDR組均有明顯增加，且組間差異具有統計學意義。與Ctrl組相比，其他三組細胞中的Caspase3蛋白的表達水平均明顯增加。Caspase家族在凋亡的調節中具有重要作用，且Caspase3是最重要的凋亡執行因子之一[14]。本研究中，125I-CLDR組的Caspases3蛋白表達水平持續升高，說明在125I-CLDR照射下，Hep2細胞凋亡有持續增加的趨勢。

當DNA受損時，細胞周期的進程會被中斷，修復蛋白NF-κB等的表達量會上調以便能夠修復細胞的損傷。這個過程由細胞周期檢測點Cyclin/ Cdk復合物來調控。DNA損傷后，通過p53的穩定表達，上調p21的轉錄，p21結合并抑制CyclinE/ Cdk2及CyclinD/Cdk4/6。p21是抑制進入G1/S期的重要因子。細胞要進入有絲分裂期需要CyclinB1/Cdk1復合物的活化[15-16]。CyclinB1在G1期表達水平很低，隨著細胞的進程，CyclinB1表達逐漸升高，在G2期表達水平最高，并與Cdk1結合，形成無活性的CyclinB1/Cdk1復合體。在G2/M期，磷酸化的Cdc25c介導CyclinB1/Cdk1復合體的活化，從而促進細胞進入有絲分裂的進程[16]。本研究中，經過三組不同方式照射后，Hep2細胞均出現了G1期細胞比例下降，G2/M期細胞比例增加，雖然三個照射組之間相應細胞周期細胞比例并沒有顯著的統計學差異，但是其中以125I-CLDR組的變化最明顯。照射后，125I-CLDR組Hep2細胞CyclinB1蛋白表達上調最明顯，而p-Cdc25c表達水平最低，說明細胞被持續阻滯于G2期，很可能是由于125I粒子持續低劑量率照射抑制了CyclinB1/ Cdk1復合體的活化。由于細胞處于G2/M期時對照射更敏感，因此，125I粒子持續低劑量率照射可能更容易引起Hep2細胞的損傷。

本研究中，125I粒子持續低劑量率照射可導致Hep2細胞凋亡率明顯增加，出現持續的G2/M期阻滯，克隆形成能力明顯下降，說明125I粒子持續低劑量率照射能夠顯著抑制Hep2細胞增殖。雖然125I粒子持續低劑量率照射治療喉鱗癌在臨床上是否可行還需被驗證，但125I粒子持續低劑量率照射對Hep2細胞的抑制作用對進一步研究有重要的參考價值。

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The inhibition effectsof different irradiationmethodson human laryngealsquamous carcinoma cell line Hep2

HUANG Li1LIU Jing-jia1DU Li-fa1QU Ang1ZHAO Yong2WANG Jun-jie1#Zhang Jian-guo3Zhang Jie3

1Cancer center,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China
2State Key Laboratory of Biomembraneand Membrane Biotechnology,Instituteof Zoology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China3DepartmentofOraland Maxillofacial Surgery,Peking University Schooland Hospitalof Stomatology,Beijing 100081,China

ObjectiveTo investigate the inhibition effects of different irradiation methods on the proliferation of Hep2,which is the human laryngeal squamous carcinoma cell line,and the corresponding mechanisms.MethodFour groups of patients receiving different irradiations were compared in our experiment,which were non-radiation control group(Ctrl),high dose rate single dose radiation group(SDR),high dose rate fractionated dose radiation group(FDR),and iodine-125 seeds continuous low dose rate radiation group(125I-CLDR),respectively.Colony formation assay was used to determine the radiosensitivity of Hep2 cells to each radiation,and flow cytometry was appliedfor detecting cell apoptosis and cell cycle arrest,while the protein expression levels ofγ-H2AX,CyclinB1 and Caspase3 were detected w ith Western blot.ResultThe capability of clone formation of Hep2 cells after 2 Gy,4 Gy,6 Gy irradiation was lower in125I-CLDR group compare w ith SDR and FDR group.After 4 Gy irradiation,125I-CLDR induced the most significant Hep2 cells arrest effect of G2/M among the three groups.And the highest cell apoptosis proportion was seen in125I-CLDR group either.The expression levels ofγ-H2AX,CyclinB1,Caspase3,NF-κB,P21 and Cdk1 increased among three treatment groups.While p-Cdc25c expressed the least in125I-CLDR group.ConclusionIn the context of this study,125I-CLDR obviously reduces cellular DNA repair capacity,induces cell apoptosis and G2/M arrest,and inhibits cell reproliferation.

125I radioactive seeds;low dose rate radiation;Hep2 cells;DNA damage;cell cycle

R739.65

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.01.14

#通信作者（corresponding author），e-mail：junjiewang_edu@sina.cn

2014-06-27）