氯化鈷誘導上皮間充質轉化并增加膠質瘤T 98 G細胞侵襲能力的研究

鄧 瑾 葉家才 黃賴機 廖志偉

廣州醫科大學附屬腫瘤醫院放療科，廣東 廣州 510095

膠質瘤是中樞神經系統常見的腫瘤，盡管神經外科學在近年來得到飛速發展，但目前膠質瘤的臨床療效并沒有取得突破性進展。放療是腦膠質瘤綜合治療的重要手段，但由于多數膠質瘤對放療敏感性較低，放療效果并不理想[1]。上皮間充質轉化 （epithelialmesenchymal transition，EMT）在膠質瘤細胞的侵襲和轉移中起重要作用。細胞發生EMT后表現為對放療和藥物治療的抵抗，并成為腫瘤復發的根源。

目前腫瘤細胞耐受放射線的機制尚未完全闡明，有研究認為實體瘤中普遍存在的缺氧是影響放射敏感性的重要原因之一[2]。缺氧微環境對腫瘤遷移和進展具有極其重要作用。越來越多的研究表明，缺氧促進腫瘤轉移與腫瘤EMT有關[3-4]。既往研究已經顯示氯化鈷（CoCl2）能模擬體內缺氧環境。因此，本研究擬通過氯化鈷模擬體內缺氧環境，進一步討論氯化鈷對膠質瘤細胞EMT和侵襲能力的影響，為膠質瘤治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及分組

人腦膠質瘤細胞株T98G購自中科院上海細胞庫，按常規方法生長在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的High Glucose DMEM培養基中，處于對數生長期狀態良好的細胞用0.05%胰酶消化傳代，取指數生長期細胞進行實驗。實驗分三組，分別接種至60 mm培養皿，待細胞融合度為80%左右時，以0.3%的低血清培養基繼續培養24 h使其同步化，然后向其中一皿加入二甲基亞砜（DMSO）作為對照孔，另外兩皿中加入氯化鈷誘導細胞缺氧，濃度分別為 100、200 μmol/L。

1.2 蛋白印跡法檢測EMT標記蛋白表達

以氯化鈷誘導細胞缺氧后，收集各組細胞，裂解液裂解細胞后提取總蛋白，從收集的細胞蛋白提取物中取5 μL進行蛋白定量。定量后進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后轉膜，放置5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h。用5%的脫脂奶粉稀釋鈣黏蛋白 （E-cadherin）（1∶500）和波形蛋白（Vimentin）（1∶2000）。含目的條帶的膜與稀釋后一抗4℃孵育過夜，TBS沖洗。辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗，室溫孵育1 h。增強化學發光法（ECL）顯色，暗室膠片成像，結果掃描并定量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參照。各蛋白的相對含量通過目的條帶的灰度值與內對照條帶灰度值的比值表示，通過觀察電泳條帶的深淺強度判斷EMT蛋白的表達水平。

1.3 Transwell和Boyden體外遷移實驗

取對數生長期的細胞，消化成單細胞懸液后計數，調整濃度為2.0×105/mL；Boyden實驗在小室下部加入一定量基質膠。將細胞加入Transwell或Boyden的上室，每孔加入100 μL細胞懸液。在Transwell或Boyden小室底部加入700 μL無血清培養基。同時在對照孔中加入DMSO，在處理組中加入終濃度為200 μmol/L的氯化鈷。37℃，5%CO2培養箱中培養過夜，每組細胞做3個平行孔。取出小室，用鑷子小心取出濾膜，吸干上室液體，甲醇室溫固定30 min；結晶紫染色。用棉簽擦去上層膠和上室未穿膜的細胞。在顯微鏡100倍光鏡下隨機挑取10個視野計數穿膜的細胞。以遷移細胞的絕對數目表示腫瘤細胞的遷移能力。

1.4 統計學方法

統計分析使用SPSS 13.0統計軟件進行分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯化鈷誘導缺氧對T98G細胞形態的改變

將在生長對數期的T98G細胞接種至60 mm培養皿，共2皿。待細胞融合度為70%左右時，換上低血清（0.3%胎牛血清）培養基，向其中一皿加入DMSO作為對照孔，另外一皿中加入氯化鈷，使其終濃度為200 μmol/L，繼續培養24 h后置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。結果發現對照組細胞大小較為均一，細胞邊緣輪廓整齊清晰。200 μmol/L的氯化鈷處理后的細胞，細胞輪廓較為粗糙，細胞呈現顯著梭型變，部分細胞開始脫落。具體形態見圖1。

圖1 氯化鈷誘導對T98G細胞形態的影響（100×）

2.2 氯化鈷對T98G細胞EMT相關蛋白表達的影響

分別用100 μmol/L和200 μmol/L的氯化鈷處理細胞后，檢測EMT標記蛋白E-cadherin和Vimentin的表達情況。Western blot結果顯示，相對于對照組細胞，氯化鈷處理細胞誘導細胞缺氧后，E-cadherin表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而Vimentin的表達顯著增加（P＜0.01）。100 μmol/L氯化鈷處理細胞后，E-cadherin 的表達由 （100.0±12.1）%降至 （77.0±14.1）%，Vimentin 的 表 達 由 （100.0±11.5）% 增 加 至（179.4±25.4）%，隨著氯化鈷濃度增加至 200 μmol/L，E-cadherin 也進一步降低至 （68.0±13.8）%（圖 2A），Vimentin 的表達也升高至（210.5±34.4）%（圖 2B）。但是 100 μmol/L和 200 μmol/L的氯化鈷處理的細胞E-cadherin和Vimentin的表達差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

圖2 Western blot檢測不同濃度CoCl2對T98G細胞EMT相關蛋白E-Cadherin和Vimentin表達的影響

2.3 氯化鈷誘導缺氧促進T98G細胞體外遷移能力

通過Transwell侵襲小室觀察T98G細胞在缺氧和常氧環境下體外遷移能力的變化。如圖3A所示，以氯化鈷處理的細胞較對照組細胞遷移率顯著增加，透膜細胞數分別為（29±5）個和（53±4）個（P=0.0397）。Boyden實驗同樣顯示，氯化鈷處理膠質瘤細胞后，穿過小室細胞數量由對照組的（26±3）個增加至（36±2）個（P=0.0402）（圖 3B）。說明氯化鈷處理后，T98G 細胞遷移及侵襲能力顯著增加。

圖3 Transwell和Boyden法檢測氯化鈷對T98G細胞體外侵襲能力的影響

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤。以往腦膠質瘤的治療以手術為主，但鑒于腦組織功能的特殊性，手術難以擴大切除范圍，術后易復發。放療是腦膠質瘤術后重要的治療手段，但是腦膠質瘤放射敏感性存在很大差異。EMT在膠質瘤侵襲轉移中起關鍵作用，是腫瘤轉移和放化療抵抗的重要因素。目前腫瘤細胞耐受放射線的機制尚未完全闡明，有研究表明腫瘤微環境缺氧可能是影響腫瘤細胞放射敏感的重要因素[5]。

細胞失控性生長是惡性腫瘤的主要特征，不斷增多的細胞導致細胞耗氧量的增加，從而造成腫瘤內缺氧微環境的形成。缺氧可以使細胞產生適應性改變，促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移。缺氧也給腫瘤的治療帶來不便，腫瘤多種惡性生物學行為包括放化療抵抗、增殖和血管生成等都與缺氧相關[6]。

缺氧誘導模型主要有兩種，即物理缺氧模型和化學缺氧模型。物理缺氧模型通過改變氧分壓，使細胞處于低氧狀態，其優點是與體內細胞缺氧的生理狀況相接近，但需要專業的設備和器械，費用高昂。而化學缺氧模型通過氯化鈷抑制低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的特異性脯氨酸羥化酶而抑制HIF-1α的強化，從而阻斷其泛素化降解，進而活化HIF-1α信號通路。筆者既往研究發現，氯化鈷可使T98G細胞HIF-1α蛋白水平明顯升高，且其在一定的時間劑量范圍內是安全的，并不造成顯著的細胞毒性[7]。更重要的是，Manotham等[8]同樣通過氯化鈷來模擬低氧環境。因此，本實驗選擇氯化鈷化學缺氧模型研究膠質瘤T98G細胞在缺氧條件下的生物學特性。

EMT在腫瘤侵襲轉移中起關鍵作用，腫瘤細胞通過EMT獲得侵襲性表型，使得其游走遷移能力及降解細胞外基質能力增強。在EMT的發生過程中，細胞表型發生相應改變：一方面，腫瘤細胞喪失了上皮表型如E-cadherin和β-catenin的表達；另一方面又獲得了間充質表型如Vimentin和Fibronectin等表達[9-10]。缺氧是誘導癌細胞EMT轉化的重要生物因素之一[11]。本實驗結果表明氯化鈷誘導缺氧后，T98G細胞中上皮細胞標記表型E-cadherin表達降低，而間充質細胞標志蛋白Vimentin表達增加，提示氯化鈷誘導缺氧后T98G細胞發生EMT。腫瘤細胞本身的遷移和運動能力在腫瘤細胞侵襲轉移過程中發揮重要作用，通過Transwell侵襲小室實驗進一步說明缺氧誘導T98G細胞EMT變化后，T98G細胞遷移能力明顯增加。因此逆轉缺氧誘導EMT將可能抑制T98G細胞的侵襲轉移。與本研究結果一致的是，Zhang等[12]研究顯示，氯化鈷能通過低氧促進Snail1表達，促進EMT的發生和肝癌細胞侵襲能力；更重要的是，去除氯化鈷后能逆轉其所誘導的EMT，Snail1 mRNA和蛋白表達水平同樣下降至未處理時水平。Duan等[13]研究通過氯化鈷建立體外低氧模型，而這種通過氯化鈷誘導低氧導致的肝癌細胞遷移和侵襲能力的增加以及EMT的發生能被姜黃素逆轉。

綜上所述，本研究結果表明，氯化鈷模擬體外缺氧可以促進T98G膠質瘤細胞EMT的發生，并增加腫瘤細胞遷移能力。以上發現為未來膠質瘤治療提供了可能的靶點和理論依據，為我們針對腫瘤周圍的低氧環境提供了理論基礎。

[1]金志良，孫新臣，魏青.腦膠質瘤放射敏感性基因研究的進展[J].醫學研究生學報，2007，20（7）：763-765，769.

[2]Hill RP，Marie-Egyptienne DT，Hedley DW.Cancer stem cells，hypoxia and metastasis[J].Semin Radiat Oncol，2009，19（2）：106-111.

[3]Zhang L，Huang G，Li X，et al.Hypoxia induces epithelial-mesenchymal transition via activation of SNAI1 by hypoxia-inducible factor-1alpha in hepatocellular carcinoma[J].BMC Cancer，2013，13：108.

[4]Yan W，Fu Y，Tian D，et al.PI3 kinase/Akt signaling mediates epithelial-mesenchymal transition in hypoxic hepatocellular carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，382（3）：631-636.

[5]Staab A，Loeffler J，Said HM，et al.Effects of HIF-1 inhibition by chetomin on hypoxia-related transcription and radiosensitivity in HT 1080 human fibrosarcoma cells[J].BMC Cancer，2007，7：213.

[6]Tsai YP，Wu KJ.Hypoxia-regulated target genes implicated in tumor metastasis[J].J Biomed Sci，2012，19：102.

[7]鄧瑾，田琪，程國華，等.缺氧誘導因子-1對人腦膠質瘤細胞株T98G放射線敏感性的影響[J].腫瘤預防與治療，2010，23（2）：103-106.

[8]Manotham K，Tanaka T，Matsumoto M，et al.Transdifferentiation of cultured tubular cells induced by hypoxia[J].Kidney Int，2004，65（3）：871-880.

[9]Bastid J.EMT in carcinoma progression and dissemination：facts，unanswered questions，and clinical consid erations[J].Cancer Metastasis Rev，2012，31（1-2）：277-283.

[10]Thiery JP，Acloque H，Huang RY，et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell，2009，139（5）：871-890.

[11]Jiang J，Tang YL，Liang XH.EMT：a new vision of hypoxia promoting cancer progression [J].Cancer Biol Ther，2011，11（8）：714-723.

[12]Zhang L，Huang G，Li X，et al.Hypoxia induces epithelial-mesenchymal transition via activation of SNAI1 by hypoxia-inducible factor-1alpha in hepatocellular carcinoma[J].BMC Cancer，2013，13：108.

[13]Duan W，Chang Y，Li R，et al.Curcumin inhibits hypoxia inducible factor1alphainduced epithelialmesenchymal transition in HepG2 hepatocellular carcinoma cells [J].Mol Med Rep，2014，10（5）：2505-2510.