內皮素-1和腫瘤壞死因子-α在急性低壓缺氧大鼠腎組織中的表達和意義

牛天慧 郭廣進 陸承榮 羅 淵 王 喆

空軍總醫院臨床航空醫學中心實驗室，北京 100142

近年來，國內外對航空生理環境影響飛行人員的相關疾病機制研究取得了一定進展[1-3]。隨著高性能戰機的使用，使飛行人員面臨高空氣壓損傷或缺氧等生理極限的挑戰，為航空醫學提出了新的研究課題。初次進入高原的人員在意外情況下也會遭受高原缺氧環境的影響，可引起胸悶、頭痛、頭暈、惡心、嘔吐等高原反應[4]。在急性低壓缺氧環境下腎是最易受到損傷的器官，有研究顯示急性低壓缺氧可引起大鼠腎功能和腎臟結構的變化[5-7]，可造成大鼠體內血清肌酐、尿素、堿性磷酸酶顯著上升，腎小球濾過率明顯下降。電鏡下可見腎小球、腎小管、線粒體有病理變化。研究還發現急性低壓缺氧可引起大鼠腎組織發生氧化損傷，使腎組織中清除自由基的酶 [如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化酶（CAT）]活性降低，造成自由基大量堆積，導致其結構損傷和功能障礙，從而進一步證實了自由基氧化性損傷是引起腎損傷的原因之一[8]。

急性低壓缺氧對腎臟的病理損傷，是否通過內皮素-1（ET-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的表達或是通過其他途徑損傷尚不清楚。為此，本實驗通過觀察ET-1和TNF-α在急性低壓缺氧大鼠腎組織中的表達情況，進一步闡明腎損傷的機制，為探討有關防護措施的效果提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

選擇SPF級雄性Wistar大鼠16只，體重（200±20）g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號：[SCXK（軍）2012-0004]。動物飼養在大鼠獨立通風換氣籠（IVC）系統內，使用許可證號：[SYXK（軍）2012-0010]。飼養環境嚴格控制，溫度20～25℃，日溫差≤3℃，濕度40%～50%，空氣潔凈度10 000級，14 h黑暗，人工光照照明（8∶00～18∶00），飼喂 SPF 鼠料，飲用無菌過濾水。

1.2 儀器與試劑

小型動物低壓艙由空軍航空醫學研究所研制；UV-2201紫外分光光度計由日本島津公司生產；高速冷凍離心機由上海安亭科學儀器廠生產；速眠新Ⅱ由吉林省華牧動物保健品有限公司提供（批號：130412）；鹽酸氯胺酮注射液由上海第一生化藥業有限公司提供（批號：H31021897）；ET-1多克隆抗體和TNF-α單克隆抗體購于北京邦定公司；SOD、CAT和MDA試劑盒購于南京建成生物工程研究所；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、山羊血清、二抗、二氨基聯苯胺（DAB）、PBS緩沖液和蘇木素染液購于北京中杉金橋生物技術公司；過氧化氫、甲醇和二甲苯購于北京化工廠。

1.3 動物模型建立

Wistar大鼠適應性飼養1周后，用完全隨機法，采用實驗對照方式，進行縱向觀察研究。將Wistar大鼠隨機均分為地面組和8.0 km組，每組各8只，參照尹世敏等[9]方法進行急性低壓缺氧實驗。將Wistar大鼠暴露于模擬海拔8.0 km低壓艙內30 min，造成缺氧。然后以30 m/s的速度下降至地面，制成大鼠急性低壓缺氧模型。地面組在另一低壓艙內30 min不進行低壓缺氧，同時觀察大鼠行為狀態。整個實驗設計符合實驗動物福利和倫理要求。

1.4 標本收集

所有動物均用速眠新Ⅱ與氯胺酮復合麻醉開腹，從腹主動脈取血5 mL分別放入非抗凝管中，以3000 r/min離心15 min，分別提取血清用于SOD、CAT活性和MDA含量測定；同時取每組大鼠左腎組織，用于免疫組織化學檢測。

1.5 免疫組織化學檢測方法

參照周敬等[10]采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin peroxidase conjugated method，SP法）檢測各組大鼠腎組織ET-1和TNF-α的表達。第一抗體選用ET-1多克隆抗體和TNF-α單克隆抗體。取各組大鼠腎組織，石蠟包埋切片，厚2 μm，烤片2 h，常規脫蠟至水，PBS沖洗，5 min×3次，加0.1%Triton X-100常溫下處理10 min，3%過氧化氫-甲醇溶液處理 15 min，PBS 沖洗，5 min×3 次，10%的山羊血清封閉15 min，分別加ET-1多克隆抗體和TNF-α單克隆抗體孵育，4℃過夜；PBS 沖洗，5 min×3 次，16 h后加二抗，37℃處理 30 min；PBS 沖洗，5 min×3 次，DAB顯色，蘇木素復染，經二甲苯透明后中性樹膠封片。組織染成黃褐色為陽性。應用北京航空航天大學病理圖像分析系統進行分析，隨機計算每例切片20個不重疊的200倍視野中陽性細胞的平均吸光度，平均吸光度表示在視野內所有陽性細胞的平均反應強度，其中染色陽性細胞占觀察細胞總數的比例即為陽性表達率。

1.6 生化指標檢測方法

按南京建成生物工程研究所測定試劑盒說明檢測各組大鼠血清中的SOD、CAT活性和丙二醛（MDA）含量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 10.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為狀態

8.0km缺氧組實驗開始后大鼠自由活動，精神正常，5 min后逐漸轉為精神欠佳，少動；10 min后出現洗臉樣動作，抓撓軀體及四肢皮毛，表現煩躁、興奮，對聲音及敲擊艙壁有警覺；隨著缺氧程度的加深，大鼠逐漸變得安靜，眼睛閉合，呼吸急促，幅度減低，蜷縮不動，出現紫紺，對聲音及敲擊艙壁無反應。提示低壓缺氧時大鼠可通過一系列適應性、代償性反應對抗低壓缺氧的刺激。實驗結束后，出艙大鼠無一例死亡。地面組在實驗過程中活動、精神狀態良好，無異常反應。

2.2 免疫組織化學檢測結果

急性低壓缺氧后經SP法免疫組織化學染色檢測，8.0 km組與地面組比較，8.0 km組ET-1和TNF-α的陽性表達明顯增強（圖1）。與地面組比較陽性表達率明顯增高，具有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

圖1 腎組織ET-1和TNF-α免疫組化結果（SP法，400×）

表1 兩組大鼠腎臟ET-1和TNF-α免疫組織化學表達結果（%，）

表1 兩組大鼠腎臟ET-1和TNF-α免疫組織化學表達結果（%，）

注：與地面組比較：*P ＜0.05；ET-1：內皮素-1；TMF-α：腫瘤壞死因子-α

組別 只數 ET-1 TNF-α地面組8.0 km組88 0.11±0.06 0.27±0.01*0.07±0.05 0.25±0.06*

2.3 大鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量變化

急性低壓缺氧后經SOD、CAT活性和MDA含量測定，8.0 km組與地面組比較，8.0 km組大鼠血清中MDA含量明顯增高 （P＜0.05），SOD和CAT活性變化不大。見表2。

表2 大鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量的變化（）

表2 大鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量的變化（）

注：與地面組比較，*P＜0.05；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：過氧化氫酶；MDA：丙二醛

SOD（NU/mL） CAT（μ /mL） MDA（nmol/mL）地面組8.0 km組組別 只數88 25.90±4.48 26.59±2.23 13.80±0.64 11.40±1.22 1.95±0.37 3.77±0.73*

3 討論

高空缺氧是航空航天生理學中一個重要課題，至今仍是影響航空飛行安全的一個重要因素。依據急性高空缺氧的癥狀表現，將高度超過7.0 km的高空定為危險區，暴露在此高度機體的代償反應已不足以保證重要器官的最低氧需要量，很快即出現多個系統功能的嚴重障礙，對飛行員和航天員的飛行安全構成嚴重威脅。因此，應用小型動物低壓艙開展急性低壓缺氧的研究具有重要意義。小型動物低壓艙具有結構簡單、成本低、實用、穩定的特點，為開展航空醫學、高原醫學研究提供了一種實驗平臺。

關于急性低壓缺氧引起腎損傷的機制多數認為與氧化應激有關。氧化應激可引起活性氧、自由基在體內增多，最終導致機體氧化和抗氧化失衡及氧化損傷[11-13]。在正常情況下，體內清除自由基的酶（如SOD、CAT）可有效清除并抑制細胞中多余自由基的生成，以維持體內自由基的平衡。自由基的產生使生物膜脂質過氧化而產生MDA，MDA含量可直接反映出細胞氧化應激損傷的強度和速度。本實驗通過測定大鼠血清中SOD、CAT活性和MDA含量的變化，發現急性低壓缺氧所引起氧化應激反應的程度不同。在急性低壓缺氧后，血清MDA含量升高，反映體內的脂質過氧化反應明顯增強，但SOD和CAT活性變化不明顯。其原因可能是30 min缺氧程度比較輕，抗氧化損傷也比較輕，再加上機體抗氧化系統的初步動員使自由基得以清除，這與常耀明等[14]的研究結果一致。同時也不能排除存在其他潛在的抗氧化物質。

急性低壓缺氧對腎臟的病理損傷，是否通過其他途徑損傷尚不清楚。基于此假設，本實驗對急性低壓缺氧腎組織內ET-1和TNF-α的表達情況進行了初步探討。ET-1是主要由血管內皮細胞合成與分泌的一類縮血管活性肽，由21個氨基酸組成，其對腎血管的縮血管效應比其他血管還強[15]。動物實驗證實急性低壓缺氧環境中腎小球細胞、腎小管上皮細胞均會受到損傷，使腎小球產生ET-1明顯增多，導致腎小球大量釋放血小板激活因子（PAF），PAF可直接引起腎小球通透性的改變和腎小球膜上皮收縮。本實驗中ET-1陽性表達率明顯強于地面組，說明局部ET-1濃度的升高可使缺氧缺血區血管產生強烈而持久的收縮，從而加重缺氧缺血性腎組織損傷。TNF-α是主要由單核-巨噬細胞以及腎臟的內皮細胞、腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞等多種細胞所產生的一種重要細胞因子[16-17]，在炎癥介導的過程中起著重要作用。TNF-α既是重要的炎癥介質，又能參與組織損傷后的修復和重建[18]。TNF-α大量表達后，可直接對腎組織產生毒性作用，導致細胞凋亡，進一步加重腎臟損傷。本實驗中TNF-α陽性表達率明顯強于地面組，說明TNF-α直接損傷腎小管上皮細胞和腎小球內皮細胞，促進炎性反應。

綜上所述，ET-1和TNF-α可引起急性低壓缺氧應激條件下腎臟的病理損傷，可能與腎臟病理損傷密切相關，可作為反映缺氧性腎損傷程度的重要指標。通過對腎臟病理損傷機制的研究可以評價藥物對缺氧機體的保護作用，已有研究顯示一些中草藥具有抗缺氧作用[19-21]。相信隨著急性低壓缺氧應激條件下腎損傷機制研究的不斷深入，將為探討有關防護措施提供更加堅實的理論基礎。

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