川黃柏中鹽酸小檗堿提取新工藝的研究

趙偉杰

臺州職業技術學院生化制藥研發中心，浙江 臺州 318000

黃柏為傳統中藥材，始載于《神農本草經》，為蕓香科植物黃檗或黃皮樹的干燥樹皮。前者習稱“關黃柏”，主產于遼寧、吉林、黑龍江、河北、內蒙古等地；后者習稱“川黃柏”，主產于四川、湖北、貴州、云南、陜西、廣西等地[1-2]。2010年版《中國藥典》記錄，二者雖成分種類和成分含量上存在差異，但功能主治、用法用量均相同[3]。即具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等功效，臨床常用于治療濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、熱淋澀痛、腳氣痿躄，骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒、濕疹濕瘡等病癥[4]。黃柏的生物活性成分除提取物、總生物堿外，還包括了鹽酸小檗堿、黃柏堿、木蘭堿、巴馬汀、藥根堿、黃柏酮、黃柏內酯等單體化合物[5]，其中主要活性成分為鹽酸小檗堿，因其具有較好的藥理作用，臨床應用廣泛[6]。

超聲波輔助提取方法具有省時、節能、提取效率高等優點，且無需加熱過程，可避免加熱因素引起的藥物成分結構發生變化，與傳統的提取方法如煎煮法、浸漬法、回流法、滲漉法相比，可以較大程度地提高目標成分的提取率[7]。本試驗以川黃柏為原料，采用浸泡-超聲法進行提取，并用正交試驗設計方法對川黃柏中鹽酸小檗堿的超聲提取工藝進行優化，確定最佳工藝參數，為川黃柏的藥用研究提供一定的實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率40 kHz，功率100 W）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率40 kHz，功率250 W）；DS-7510DTH超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司，頻率40 kHz，功率450 W）；循環水式真空泵 （臺州市信力電子設備有限公司）；1260高效液相高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；30B型萬能粉碎機（江陰市鑫達藥化機械制造有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈為色譜純（美國Sigma-Aldrich公司），實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.l分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，含 0.1%的十二烷基硫酸鈉）；檢測波長265 nm，流速 1 mL/min，柱溫 40℃，進樣量 10 μL[8-9]。色譜圖見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿對照品（A）和供試品（B）的HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品5.77 mg，置于5 mL量瓶中，加色譜純乙腈溶解并定容，搖勻，制得1 mg/mL對照品儲備液備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取川黃柏小片（約5 mm×5 mm）20.0 g，按一定料液比加入提取溶劑，浸泡24 h，置于超聲波清洗器中在一定功率、溫度下提取，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加一定濃度的NaCl水溶液 （加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。精密稱定生物堿粉末，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入色譜純乙腈25 mL，搖勻，濾過，取濾液作為供試品溶液（在提取工藝研究中改變相應參數）。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取鹽酸小檗堿對照品儲備液 0.25、0.5、1、2、4 mL 置于 5 mL 量瓶中， 用色譜純乙腈定容至刻度，同“2.1.1”項下色譜條件分別進樣3次，進樣量 10 μL。以平均峰面積（Y）對進樣質量濃度（X）進行線性回歸分析，得回歸方程Y＝38 854.3878 X－84.306 14，r＝ 0.999 93， 表明鹽酸小檗堿在0.05～0.8 mg/mL線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，同“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰，計算得鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.24%。

2.1.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，室溫下放置，分別在制備后0、1、2、4、6、8、10、12 h按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積，并計算其峰面積的RSD為0.52%，表明穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 稱取川黃柏小片6份，每份5.0 g，按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得鹽酸小檗堿質量分數的RSD為1.53%

隨著信息技術和經濟環境的不斷發展，傳統財會管理模式逐漸發生變化，我國經濟發展模式正由傳統的投資拉動經濟增長模式轉變為資本節約型經濟管理模式。新時期下的企業財務轉型，對財會工作人員綜合能力也提出了更高要求。財務轉型即借助現代信息技術及管理會計等方式，將核算型財務轉變為管理決策型財務，并將財會工作積極融入到企業日常經營決策中，并充分發揮自身具備的財務管理價值。

2.1.8 回收率試驗 稱取川黃柏小片6份，每份5.0 g，置25 mL量瓶中，每份加入小檗堿對照品儲備液適量，按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算得鹽酸小檗堿平均加樣回收率為98.46%，RSD為1.81%。

2.1.9 樣品的測定 分別吸取對照品溶液和供試品溶液各1 mL，經0.45 μm微孔過濾器過濾進樣瓶中，同“2.1.1”項下色譜條件進行測定，外標法計算，即得樣品中小檗堿的質量分數。

2.2 單因素試驗

以鹽酸小檗堿提取率為考察指標，通過單因素試驗確定影響鹽酸小檗堿提取率的因素。提取率＝提取出的鹽酸小檗堿質量/川黃柏質量×100%

2.2.1 提取方法的選擇 稱取黃柏小片20.0 g，按一定料液比加入提取溶劑，浸泡24 h，平行2份：第1組，抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加入一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末；第2組，置于超聲波清洗器中在一定功率、溫度下提取，趁熱抽濾，濾液靜置過夜，加入HCl調至pH=2，再加一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。每組提取重復3次，按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，得到超聲輔助提取率為4.74%（RSD為0.42%），浸泡提取率3.21%（RSD為0.24%）。由此可見，超聲輔助提取鹽酸小檗堿的提取率明顯高于浸提法提取的鹽酸小檗堿，故采用超聲輔助提取法提取鹽酸小檗堿。

2.2.2 提取溶劑的選擇 稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑分別為 HCl-甲醇（1∶100）、HCl-乙醇（1∶100）、HCl-水（1∶100），按一定料液比浸泡 24 h，置于超聲波清洗器中在一定功率、溫度下提取，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加入一定濃度的Na-Cl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。用HCl-甲醇提取鹽酸小檗堿的提取率最高，這是由于甲醇穿透植物細胞壁的能力強、極性大、對生物堿的溶解性能好，而且沸點也較低[10]，故選擇HCl-甲醇為提取溶劑。見表1。

表1 提取溶劑對鹽酸小檗堿提取率的影響（n=3）

2.2.3 提取劑中甲醇的所占百分比 稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑分別為 HCl-60%甲醇（1∶100）、HCl-70%甲醇（1∶100）、HCl-80%甲醇（1∶100）、HCl-90%甲醇（1∶100），按一定料液比浸泡 24 h，置于超聲波清洗器中在一定功率、溫度下提取，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加入一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。用HCl-70%甲醇提取鹽酸小檗堿的提取率最高，說明黃柏中鹽酸小檗堿在HCl-70%甲醇溶液中溶出度最大，故選擇HCl-70%甲醇為提取溶劑。見表2。

表2 提取溶劑濃度對鹽酸小檗堿提取率的影響（n=3）

2.2.4 料液比的選擇 稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑為 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g ∶mL），浸泡 24 h，置于超聲波清洗器中在一定功率、溫度下提取，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加入一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。按照 “2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。在料液比 1∶10～1∶20范圍內，提取率變化較快，當料液比超過1∶20時，鹽酸小檗堿的提取率雖也有所增加，但增加較緩慢，為了節省溶劑及方便后續處理，故選擇料液比為1∶20。見表3。

表3 料液比對鹽酸小檗堿提取率的影響（n=3）

2.2.5 超聲功率的選擇 稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑為 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比為 1∶20，浸泡24 h，超聲功率分別為 100、250、400 W，在一定溫度下提取，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。用超聲功率250 W提取鹽酸小檗堿提取率最高，當功率大于250 W，提取率會隨之下降。這可能是由于超聲提取過程中，隨著功率的增大，超聲波空化作用增強，產生的空化泡破碎越劇烈，有效成分提取率越高，但功率過高，有些目標成分結構可能會被破壞，并且非有效成分也會大量溶解到提取溶劑中，有效成分溶解量相對減少[11]。故選擇250 W為超聲提取功率。見表4。

表4 超聲提取功率對小檗堿提取率的影響（n=3）

2.2.6 超聲溫度的選擇 稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑為 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比為 1∶20，浸泡24 h，超聲功率250 W，超聲溫度分別為40、50、60、70℃提取，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加入一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。超聲溫度升高，鹽酸小檗堿提取率也隨之逐漸增大，當超聲溫度為60℃時提取率最大，但隨著超聲溫度繼續升高，提取率卻有下降的趨勢。這可能是由于超聲溫度過高會對溶出的鹽酸小檗堿結構造成破壞，同時增大甲醇的揮發量，最終導致鹽酸小檗堿提取率降低[12]，故選擇60℃為提取溫度。見表5。

表5 超聲溫度對鹽酸小檗堿提取率的影響（n=3）

2.2.7 超聲時間的選擇 稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑為 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比為 1∶20，浸泡 24 h，超聲功率250 W，超聲溫度60℃，超聲提取30、40、50、60 min，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加入一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。隨著提取時間的延長，提取率也逐漸增加，但在50～60 min時增加幅度降低，故選擇50 min為提取時間。見表6。

表6 超聲時間對鹽酸小檗堿提取率的影響（n=3）

2.2.8 提取次數的選擇 稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑為 HCl-70%甲醇（1∶100），料液比為 1∶20，浸泡24 h，超聲功率250 W，超聲溫度60℃，超聲50 min，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，加一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析24 h，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末，為提取1次。然后將濾渣重復上述步驟進行2、3、4次提取。按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。提取次數為2次時，鹽酸小檗堿提取率明顯低于第1次，以后基本沒有鹽酸小檗堿提取出來，說明此方法適合于提取黃柏中鹽酸小檗堿，且一次提取較完全。見表7。

表7 提取次數對鹽酸小檗堿提取率的影響（n=3）

稱取黃柏小片20.0 g，提取溶劑為HCl-70%甲醇（1∶100），料液比為 1∶20，浸泡 24 h，超聲功率 250 W，超聲溫度60℃，超聲50 min，趁熱抽濾，濾液靜置過夜。加入HCl調至pH=2，再加入一定濃度的NaCl水溶液（加入量以提取液量的10%計算）攪拌，靜置鹽析 12、24、36、48 h，過濾，洗滌沉淀，干燥，得生物堿粉末。按照“2.1.3”項下方法進行供試品溶液制備，并按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。隨著鹽析時間的延長，鹽酸小檗堿的析出量逐漸增多，鹽析36 h后小檗堿提取率趨于平緩，故選擇36 h為鹽析時間。見表8。

表8 鹽析時間對小檗堿提取率的影響（n=3）

2.3 正交試驗

以鹽酸小檗堿提取率為考察指標，根據單因素試驗結果，選擇料液比（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）為主要考察因素，進行 L9（34）正交試驗確定最佳工藝參數，正交試驗設計及結果見表9，方差分析見表10。

由直觀分析可知，各因素的重要性依次為A＞D＞C＞B。通過方差分析可知，4個因素中，A、D具有顯著性影響（P＜0.05），C有影響但不顯著。通過正交試驗優化的黃柏中鹽酸小檗堿最佳提取工藝為A2B2C3D2，即加入 20 倍量 HCl-70%甲醇（1∶100），超聲功率250 W，50℃提取50 min。

表9 L9（34）正交試驗設計及結果

表10 方差分析

2.4 最佳工藝驗證試驗

稱取川黃柏20.0 g，平行3份，利用正交試驗設計所優化的最佳工藝條件進行驗證試驗，測定最佳工藝條件下的鹽酸小檗堿的含量，計算其提取率分別為8.214%、8.225%、8.209%，表明該提取工藝穩定可行。

3 討論

本實驗采用超聲輔助提取川黃柏中鹽酸小檗堿，其提取率在同樣的實驗條件下明顯高于溶劑浸提法，此方法與文獻報道基本符合[13-14]；通過正交試驗多方面考察影響鹽酸小檗堿提取工藝的各種因素，進行提取工藝的篩選，優化最佳提取工藝參數，實驗結果表明，各因素的重要性依次為，料液比＞超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率，鹽酸小檗堿最佳提取工藝為，加入20 倍量 HCl-70%甲醇（1∶100），超聲功率 250 W，50℃提取50 min通過采用HPLC法定量分析進行驗證，測定的試驗結果準確、可靠，確定的提取工藝條件合理、可行，為鹽酸小檗堿的提取方法及其工業化生產提供了新手段。

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