HPLC法測定家兔血漿中士的寧的濃度

趙引利 何燕寧 楊冬麗 張東閣 楊宇杰 王春民

1.承德醫學院中藥研究所中藥實驗中心，河北 承德 067000；2.承德頸復康藥業集團有限公司藥物研究院制劑研究中心，河北 承德 067000；3.河北省中藥新輔料工程技術研究中心藥物制劑研究中心，河北 承德 067000

中藥馬錢子為馬錢科植物馬錢 （Strychnos nux-vom ica）或云南馬錢（Strychnos pierriana）的干燥成熟種子，具有通絡止痛、散結消腫等功效[1]。士的寧既是馬錢子的主要有效成分又是有毒成分，占馬錢子總生物堿的50%左右[2]。2010版《中國藥典》所收錄的含馬錢子的中成藥多以片劑、丸劑、膠囊劑等口服用藥為主，且馬錢子在中成藥中均為君藥、臣藥，表明馬錢子治療作用突出[3]。但目前以馬錢子粉或含馬錢子中成藥入藥的藥動學研究均為大鼠灌胃[4-7]，既難以進行臨床用藥劑型研究，又難以實現同一動物多次取血，較難體現藥物在同一個體內的藥動學真實情況，而家兔灌胃含馬錢子中成藥的藥動學相關研究尚未見報道。本實驗采用單因素考察，確定含藥血漿處理方法；建立高效液相色譜（HPLC）法測定家兔血漿中士的寧的濃度。以期對含馬錢子中成藥口服類用藥的藥動學研究提供方法借鑒，以指導臨床安全用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），G1329B自動進樣器，G1314FVWD檢測器；TDL-40B型離心機 （上海安亭科學儀器廠）；TG16-WS臺式高速離心機（長沙湘儀離心機有限公司）；MX-S可調式混勻儀（北京大龍興創實驗儀器有限公司）；AL104型電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；AE240型電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-700DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDA-8002型水浴鍋（余姚明偉儀表廠）。

1.1.2 藥品與材料 士的寧對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，按97.1%計；批號：110705-201307）；庚烷磺酸鈉（色譜純，天津市光復精細化工研究所；批號：20140305）；腰痛寧膠囊（頸復康藥業集團有限公司；批號：491044）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水。實驗用血漿取自新西蘭兔[許可證號：SCXK（京）2014-0003]。

1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Agilent TC-C18預柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合（用10%磷酸調pH至3.0）-乙腈（0.5∶79.5∶20.0）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃。

1.3 標準儲備液的配制

精密稱取士的寧對照品適量置10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成濃度為0.8292 mg/mL的士的寧儲備液，4℃冷藏備用。

1.4 標準溶液的配制

精密吸取士的寧儲備液適量，用流動相稀釋，得到質量濃度為 0.22、0.37、0.75、1.49、4.15、7.46、14.93 μg/mL的士的寧系列標準溶液，4℃冷藏備用。

分別將 0.37、4.15、14.93 μg/mL 士的寧標準溶液用流動相稀釋5倍，所得溶液，分別標記為士的寧標準溶液 a、b、c，4℃冷藏備用。

1.5 血漿樣品處理

1.5.1 堿液種類及濃度考察 精密吸取家兔空白血漿1.5 mL置50 mL尖底離心管中，加入4.15 μg/mL士的寧流動相溶液20 μL，渦旋30 s，配制成一定濃度的含藥血漿；加異丙醇-甲醇（4∶1）混合溶劑0.5 mL，分別考察加入 0.5 mL氨水，0.5 mL的 1、2、3 mol/L NaOH溶液，渦旋30 s，冷水中超聲15 min，加入正己烷-二氯甲烷-異丙醇（60∶35∶5）4 mL，渦旋 1 min，3000 r/min離心10 min，收集下層液，于37℃水浴氮氣吹干，用 100 μL 流動相復溶，渦旋 1 min，12000 r/min離心15 min，得供試品溶液，進樣70 μL測定[8-10]。另取士的寧標準溶液b，直接進樣70 μL測定峰面積。將供試品溶液所得士的寧峰面積與對照品流動相溶液的峰面積比較，計算士的寧絕對回收率，結果分別為32.53%、20.04%、32.41%、32.75%。由結果可得2 mol/L NaOH溶液與3 mol/L NaOH溶液、氨水的絕對回收率差別不大，但氨水揮發性強，綜合考慮選擇2 mol/L NaOH溶液。

1.5.2 萃取次數的考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液時，萃取次數分別為1次和2次時士的寧的絕對回收率。萃取1次方法同“1.5.1”項下方法；萃取2次方法同“1.5.1”項下方法，重復萃取過程2次，合并2次下層液，于37℃水浴氮氣吹干，用100 μL流動相復溶，渦旋1 min，12000 r/min離心15 min，得供試品溶液，進樣70 μL測定。士的寧絕對回收率結果分別為32.41%和62.34%，表明萃取2次結果更佳。

1.5.3 萃取劑種類的考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數為2次，分別以氯仿、二氯甲烷、氯仿-甲醇（9∶1）、二氯甲烷-甲醇（9∶1）、正己烷-二氯甲烷-異丙醇（60∶35∶5）作萃取劑時士的寧的絕對回收率[10-12]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結果分別為59.92%、73.54%、53.82%、74.97%、62.34%。根據結果可得二氯甲烷和二氯甲烷-甲醇（9∶1）所提士的寧的絕對回收率較為理想，但二氯甲烷萃取后樣品雜質較少，同時考慮操作從易的原則，選擇二氯甲烷作為萃取劑。

1.5.4 萃取劑加入量的考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數為2次，萃取劑二氯甲烷每次加入量為 3、4、5、6 mL 時士的寧的絕對回收率[13-14]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結果分別為67.94%、69.30%、79.28%、70.95%。由結果可得加入量為5 mL時，士的寧的絕對回收率較理想，故選擇每次加入量為5 mL。

繼續考察萃取劑為二氯甲烷，第1次加入量為5mL，第2次加入量分別為3、4、5 mL時士的寧的絕對回收率。方法同上，結果分別為69.58%、80.10%、79.28%。由結果可知，第2次加入量為4 mL和5 mL時結果均較理想，從節約資源的角度考慮，選擇第2次加入4 mL。

1.5.5 加萃取劑后渦旋時間考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數為2次，萃取劑為二氯甲烷，第1 次 5 mL，第 2 次 4 mL，渦旋時間分別 1、3、5 min 時士的寧的絕對回收率[15]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結果分別為81.78%、77.77%、77.63%。根據結果，渦旋3 min和5 min易產生乳化，使回收率降低，故選擇渦旋1 min。

1.5.6 破膜劑種類考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數為2次，二氯甲烷萃取渦旋1 min，第1次5 mL，第 2 次 4 mL，破膜劑分別為異丙醇-甲醇（4∶1）、異丙醇-甲醇（1∶1）和乙腈時士的寧的絕對回收率[8，16]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結果分別為81.78%、68.03%、85.22%。結果表明，乙腈做破膜劑較為理想。

1.5.7 血漿樣品處理方法 綜合以上篩選，確定血漿樣品處理方法為：精密吸取含藥血漿1.5 mL置50 mL尖底離心管中，加乙腈和2 mol/L NaOH溶液各0.5 mL，渦旋30 s，置冷水中超聲15 min，再加二氯甲烷5 mL，渦旋1 min，3000 r/min離心10 min，收集下層液；剩余血漿再加二氯甲烷4 mL，渦旋1 min，3000 r/min離心10 min，收集下層液；合并2次下層液，于37℃水浴氮氣吹干，用100 μL流動相復溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心15 min，得供試品溶液，進樣70 μL測定。

2 結果

2.1 方法專屬性

將“家兔空白血漿+士的寧對照”樣品、家兔灌胃腰痛寧膠囊后的含藥血樣、家兔空白血漿，按“1.5.7”項下方法操作，考察方法專屬性。見圖1。

2.2 線性關系試驗

精密吸取7份家兔空白血漿各1.5 mL，分別加入士的寧對照品系列標準溶液20 μL，渦旋30 s，配制成相當于士的寧濃度為 2.99、4.98、9.95、19.90、55.28、99.51、199.02 ng/mL 的系列標準樣品，再按“1.5.7”項下方法操作。以士的寧血漿濃度C（ng/mL）為橫坐標X，峰面積A為縱坐標Y，建立標準曲線；用加權（1/C2）最小二乘法進行線性回歸運算；以S/N=10測定最低定量限。得線性回歸方程為：Y=1.386 X+1.022，r=0.9985，線性范圍為：2.99～199.02 ng/mL，最低定量限為 0.10 ng。

2.3 回收率試驗

同“2.2”項下方法配制低、中、高 3個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）質控血漿樣品各 5 份，按“1.5.7”項下方法操作，同時繪制隨行標準曲線，記錄士的寧峰面積AT，計算質控血漿樣品中士的寧濃度，用實測濃度平均值與理論濃度比較，求得方法回收率；另取士的寧標準溶液 a、b、c各 5份， 直接進樣 70 μL，記錄士的寧峰面積AS，用AT平均值與AS平均值比較，求得絕對回收率，結果表明士的寧的絕對回收率均＞70%，方法回收率：低濃度在80%～120%，中、高濃度在85%～115%，均符合要求。見表1。

2.4 精密度試驗

精密吸取家兔空白血漿1.5 mL，加入流動相配制的士的寧系列濃度對照品溶液20 μL，渦旋30 s，配制成低、中、高 3 個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）的質控血漿樣品，每個濃度5份樣品，按“1.5.7”項下方法操作，于1 d內每個濃度每份樣品測定1次，同時繪制隨行標準曲線，記錄士的寧峰面積，計算質控樣品中士的寧濃度，求得3個濃度的日內精密度；連續測定5 d，每天每個濃度1個樣品，每個樣品測定1次，每天繪制1條隨行標準曲線，記錄士的寧峰面積，計算質控樣品中士的寧濃度，求得3個濃度的日間精密度，結果表明低濃度日內、日間精密度均＜20%，中、高濃度均＜15%，結果均良好。見表2。

2.5 穩定性試驗

考察 3 個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）質控樣品在室溫放置 0、4、8、12、24 h 的穩定性；-20℃及室溫凍融循環 0～3 次的穩定性；-20℃保存 0、5、10、15、20 d的穩定性。結果3個濃度樣品峰面積的平均值與0 h或0次測定值的偏差絕對值均在5%以內，表明質控樣品室溫放置24 h內和凍融循環3次以內穩定性良好；15 d和20 d樣品中士的寧發生了分解，0、5、10 d所得數據計算偏差絕對值，結果均在5%以內，證明樣品在10 d內穩定性良好。

3 個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）質控樣品，按“1.5.7”項下方法操作得到供試品溶液，考察室溫放置0、4、8、12、24 h的穩定性。結果3個濃度質控樣品峰面積測定值的平均值與0 h測定值的偏差絕對值均在5%以內，表明血樣處理后室溫放置24 h內穩定性良好。

3 討論

圖1 家兔血漿中士的寧的高效液相色譜圖

目前對含馬錢子的中成藥或馬錢子粉的藥動學研究均為大鼠灌胃[4-7]，難以對同一動物多個時間點取血，因存在個體差異性，無法體現藥物在同一個體內藥動學的真實情況；而家兔灌胃可以實現多點采血，解決了這一問題。故本實驗建立了測定家兔血漿中士的寧的檢測方法。本實驗曾試過Phenomenex C18柱、Kromasil C18柱、Inertsil ODS-3柱等，但有拖尾、峰展寬或分離困難等現象，最終確定為Agilent TC-C18柱，峰分離良好，無拖尾和峰展寬情況，理論塔板數符合要求[17-18]。在實驗初期，發現士的寧甲醇溶液進液相檢測不成線性，而改為士的寧流動相溶液則成線性，可能是由本實驗流動相的水相比例偏大造成的，故最終選擇用流動相稀釋和樣品定容。樣品處理過程中發現，加入萃取劑后超聲與否對絕對回收率無影響，說明加堿液已經使士的寧游離，可直接萃??；氮氣吹干時水浴溫度為50℃時絕對回收率降低，可能高溫使一些內源性物質對士的寧產生降解或與之結合，故最終選擇37℃[19-20]。另外，含藥血漿在-20℃儲存15 d和20 d，發現峰面積開始減小，且士的寧峰附近出現異常峰，20 d色譜圖最為明顯，士的寧峰與異常峰的峰面積之和與0 d士的寧峰面積接近，懷疑士的寧在血漿內源性物質的作用下發生了降解，故血樣-20℃存儲不宜超過10 d。本實驗所得家兔血漿中士的寧的處理方法和檢測方法可靠，有望應用到家兔灌胃含馬錢子的中成藥后士的寧的藥動學研究中。

表1 士的寧的絕對回收率與方法回收率（n=5）

表2 士的寧的日內、日間精密度（n=5）

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